病毒學方法技術的研究進展

摘 要 從早期的結晶提純到今天的分子細胞水平的病毒學研究，病毒學的研究隨著時間而不斷發展，而病毒學發展的重要依據就是相關技術方法的不斷進步。本文從病毒的鑒定檢測方法、病毒的分離與培養方法、病毒的功能機制研究方法這三個方面總結現在病毒學研究的常用方法，為通用的技術方法提供參考依據，以推動病毒研究的技術改革與創新，為今后的研究工作奠定良好的基礎。

關鍵詞 病毒學 方法 分子細胞水平

中圖分類號：G644 文獻標識碼：A

相對動物學或者植物學這些傳統學科，病毒學是一門始創于20世紀40年代的新興學科。雖然在此之前，就有發現能通過細菌過濾器的煙草花葉病致病因子的科學家D.Ivanofsky，以及發現具有濾過性的口蹄疫病原的科學家Loeffler和Frosch，但是基于歷史條件和知識水平的限制，人們或許觀察到了病毒引起的自然現象，卻無法對其產出真正科學的認識。

病毒學的里程碑事件應屬1935年美國科學家Stanley對于煙草花葉病毒的提純，使人們不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地觀察和接觸到病毒，為今后的研究開辟了廣闊的道路。隨后，觀察手段，培養方法，以及相關的病理性研究手段的不斷提升，也使得病毒學這樣一門起步較晚的學科開始了飛速發展。

回顧病毒學研究的發展歷程，不難發現，學科的發展很大程度上依賴于技術的進步與革新，以及與相關學科的借鑒與學習。故了解和掌握病毒學方法技術的發展歷史以及技術要求，對于學科的研究，以及技術的創新，都有諸多裨益。

1 病毒鑒定檢測的相關方法技術

對于病毒最直觀的認識無疑是其生物學上特征，如病毒的理化性質（如病毒粒子的形態、大小、對理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反應（如寄主范圍、癥狀表現、傳播方式等）。目前，病毒生物學特征的研究鑒定方法主要分為三大類：顯微成像技術（或相關針對病毒形態結構觀察的技術）、免疫-血清學檢測和分子生物學檢測。

1.1 病毒形態結構的觀察技術

眾所周知，病毒顆粒的大小遠小于普通細菌，所以對病毒最直觀的鑒定方法就是使用電鏡觀察，它可以直接地看到病毒的形態結構、存在與否。自第一臺電子顯微鏡的誕生，這門技術已為病毒學在內的多種生物學科作出了重要的貢獻，優點也十分明顯，操作簡便，快捷有效，所以，即使是在進入了分子研究水平的今天，電子顯微鏡仍然發揮著它不可替代的作用。

另外，在原始的技術基礎之上加以改進也形成了一些針對特殊觀察對象的電鏡技術，如電鏡負染技術和免疫電鏡檢測技術等。低溫電鏡技術，就是一種結合電鏡技術和低溫結晶觀察病毒的三維結構的技術，其優點不僅在于其分辨率更高，而且對于病毒樣品的損傷和失真的概率都大大減小，常用于極微量和高保真要求的病毒觀察檢測。

X-射線衍射技術是通過掃射病毒微晶得到的衍射圖像來分析還原原始的病毒結構，但為了保證衍射圖像的準確性，往往對樣品的純度和顆粒完整性要求較高，所以這種技術的使用范圍相對受限。

核磁共振技術，相對于前面提到的技術，對于操作的要求更低，運用范圍也更廣，但是對于結構的準確性判斷略低。此技術主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子構象變化的研究。

1.2 免疫-血清檢測方法

此類技術的原理主要根據病毒的侵染性以及其作為核蛋白的特性而設計的。運用最為廣泛的還是血清學測試，即利用血清中可以和具有某種特定結構特征的病毒結合的抗體，從而進行病毒的定性定量分析。此法也廣泛應用用于醫學臨床的診斷，操作簡便，低廉有效。

酶聯免疫吸附實驗（ELISA）也是利用特異抗體吸附病毒顆粒的原理，只是在抗體上附帶了酶標記，從而使反應可以有顏色強弱的變化，利于定時定量監測病毒濃度。此法靈敏度高，且不受濃度范圍或其他抑制劑的干擾，也越來越多地應用于相關的生產實踐中。

免疫組化技術也是將抗體帶上特殊的顯色基團，使其游離時不顯色，而于抗原物質結合后顯色。利用這個特點，可以檢測特定組織中不同區域的病毒含量已經分布特點，利于進行組織性毒理分析。

1.3 分子生物學檢測方法

病毒寄生在宿主細胞內，但它又有不同于宿主細胞的特異基因組序列，特異序列的存在就說明病毒的存在，這就是分子生物學檢測病毒的原理。

聚合酶鏈式反應（PCR）是其中最為常用的一種檢測手段，其原理即利用DNA半保留復制的特點，以原始DNA為模板合成兩條一樣的雙鏈，從而達到擴增量指數增長，DNA總量可檢測的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常規的PCR以及反轉錄PCR即可針對不同的病毒基因進行檢測。

實時定量PCR與傳統PCR基本相同，只是在體系中加入熒光基團，反應中利用CCD實時讀取熒光信號，檢測。不僅減少的污染和浪費，也使定量快速而方便，可以實現多樣品和高通量的反應。

核酸原位雜交的原理是利用生物素編輯的cDNA探針來雜交組織中的樣本，從而確定病毒在宿主中的分布和載毒量。該技術，往往與免疫組化一起使用。

dsRNA技術是利用dsRNA在一定條件下與纖維素特異結合的性質，從來快速簡便的提取檢測出病毒顆粒中的dsRNA等，高效準確，在普通實驗室和生產工廠中都有所應用。

2 病毒的分離與培養的相關技術方法

2.1 病毒的提純技術

作為病毒學研究的重要技術前提，病毒的提純質量往往影響了后續一系列的步驟，所以其重要性不言而喻。由于病毒的生長特性、理化性質和宿主都差異頗大，提純的方法也不盡一致。

在病毒研究初期，沉淀法最常被使用，其主要利用病毒的蛋白外殼，改變溶劑性質，從而分離病毒粒子。相對而言簡便快速，但也常存在粗糙易變性的缺點。

色譜法源于化學中多組分的分離，由于生物成分的多樣性，也常使用該技術。色譜法主要分為吸附法、柱層析法和電泳法，都是利用較為溫和的環境，以及病毒的特異吸附或凝集等特質而設計的技術。種類繁多，應用廣泛。

超速離心利用樣品中不同成分擁有不同的沉降系數，在離心過程中，不同成分會在溶劑的特定位置形成區帶，從而達到分離提純的目的。此法常使用生物活性溶劑，且離心本身對病毒粒子損傷較小，故常用于理想的病毒快速分離技術。

2.2 病毒的獲取

最初的植物病毒學和動物病毒學的諸多研究都是建立在活的宿主體系上的，并且至今仍在應用，如生產不能體外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、檢測疫苗的安全性等。但動物宿主體系存在太多弊病，隨著細胞培養技術和分子生物學的發展，有逐漸被淘汰的趨勢。

現在，病毒的獲取主要是三種途徑：從宿主直接獲取、感染宿主擴增病毒、直接合成，其中后兩種途徑使用更為廣泛。

感染宿主擴增病毒即要使用到組織細胞培養，這項技術本來屬于細胞學的范疇，后由于動物源性或者細菌源性的病毒研究需求，此技術也越來越多地應用于病毒學的研究中。如，空斑分析最初用于測定噬菌體含量，而今也逐漸普及為動物病毒的研究中去。

直接合成法則是利用動物轉基因技術，將病毒的遺傳信息整合進目標動物中，在動物體內完成基因的表達，蛋白的合成，以及病毒的組裝等步驟。而動物轉基因技術也是現今生物領域的熱點內容，技術繁多，更新迅速，也為病毒的研究提供了良好的基礎。

3 病毒的功能機制研究的相關技術方法

3.1 病毒的遺傳學的研究

關于病毒遺傳學的研究和細菌等微生物的遺傳學研究技術相似，如PCR等。但是病毒的遺傳物質除了可能是DNA還可能是RNA，而且現在對于RNA病毒的研究居多，所以針對性的技術也與細菌等微生物的遺傳學研究技術有所區別。

對于RNA病毒使用最多的是反向遺傳學技術，最初即使用反轉錄PCR得到病毒RNA的cDNA，從而完成病毒基因組的探索工作，以達到了解或有目的性改造病毒基因組實現生產應用的目的。此法對于類型多樣的病毒研究提供的最為基礎的遺傳學數據，為疫苗開發篩選、新型病毒載體等多方面都給予有力的技術支持。

針對病毒易變異的特點，單鏈構想多態性檢測技術（SSCP）則理想地解決了這一問題。近年來，對于多種模式生物的基因組測序的發展，越來越多的研究開始著重于探索基因變異的問題，而SSCP技術正是這樣發展起來的。其主要用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，為病毒的分子演化規律以及流行病學提供充分的證據。

基因芯片技術的概念來源于計算機芯片，即將大量寡聚核苷酸以陣列形式有序固定于載體表面，與待測樣本的病毒分子雜交，然后利用化學發光或同位素等顯色方法，用CCD等儀器對雜交信號進行高效檢測分析。主要用于病毒基因表達譜和基因多態性等方面的研究。

3.2 病毒表達機制的研究

在病毒的表達機制研究中，主要是利用不同的檢測手段，判斷病毒表達的具體情況，并對于病毒表達的情況進行總結歸納，研究其時空上的機制和規律。

Northern Blots即針對病毒RNA樣品的技術手段，原理與Southern Blots相似，利用探針與固相RNA雜交，再對探針分子的圖像進行捕獲和分析。此法特異性高，常用于分析已知基因的表達情況。

mRNA表達差異技術主要使用反轉錄PCR以及等量不同宿主的定量檢測，來確定抗病種和感病種的差異表達基因，從而進一步確定造成品種差異的原因。

3.3 病毒蛋白質的研究

病毒蛋白決定了病毒的形態結構，常作為抗原來激發人體內的免疫反應，作用于宿主細胞信號轉導途徑，導致宿主細胞內信號轉導發生紊亂；并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作為細胞毒素作用于宿主細胞。

大范圍而言，病毒蛋白質研究的技術，都隸屬于蛋白質組學的研究范疇之內，只不過針對不同特性的蛋白，往往會選取最為有效而簡便的技術方法進行研究。而由于蛋白質分子結構、化學生物特性等多方面差異很大的特點，其針對性技術也是五花八門，在此僅列舉較為常用的技術，以供研究者學習參考。

經典的方法有親和層析、抗體受體法、抗細胞受體法、抗獨特型抗體法、病毒覆蓋蛋白法。大多還是利用病毒蛋白和抗體蛋白或者其他蛋白或大分子物質的作用，來檢測病毒蛋白的特性。雖然這些方法快速簡便，但是由于方法本身較為粗糙，樣品用量較大，準確性存疑等問題，現在僅在低要求情況下使用。

現代的方法則更加豐富，也分別具有各自的特點，常被運用于現在的病毒蛋白的研究。

噬菌體表面呈現技術是利用噬菌體本身表達的兩種結構蛋白會暴露在噬菌體表面，故將外源基因倒入兩個結構蛋白基因間，使外源序列一起表達，然后讓表達產物與大量配體結合，篩選特殊結合性配體。但此法表達出來的蛋白可能與天然狀態不符，所以使用較為受限。

免疫共沉淀是一種成熟蛋白作用技術，其原理為在溶液或細胞中，用一種蛋白的抗體耦合可與此蛋白特異結合的另一蛋白，從而形成一抗體兩蛋白的沉淀，從而獲取具有結合餌蛋白能力的未知蛋白，探索細胞中蛋白作用機制。

酵母雙雜交技術是利用真核基因的特殊表達機制，通過將兩個蛋白的編碼序列整合在同一酵母細胞內的特殊轉錄激活域附近，若兩種蛋白可以發生相互作用，則會激活相應的報告基因，從而報告蛋白的相互作用。此法常用于篩選病毒蛋白的特異膜蛋白受體。

除了以上列舉的技術之外，還有cDNA文庫技術、質譜分析技術、GST Pull-down技術、串聯親和純化、熒光能量共轉移等多種技術應用于蛋白互作的研究。

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