2例苯丙酮尿癥的產前診斷分析研究

【中圖分類號】R596 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0225-02

【摘要】目的：通過對苯丙酮尿癥患者的產前情況進行診斷分析，為預防此病提供科學依據，從而提高優生優育率。方法：采用人類苯丙氨酸羥化酶cDNA限制酶片段長度進行多態性連鎖分析，收治2例苯丙酮尿癥高危胎兒做產前診斷，對結果進行統計學分析。結果：產前診斷與胎兒出生后情況或人工流產手術后的結果相符。結論：苯丙酮尿癥患者的產前情況在測定PAH活力時還存在著一定的難度，因此苯丙酮尿癥患者的產前診斷只能通過分析胎兒的PAH基因來完成。

【關鍵詞】苯丙氨酸羥化酶；脫氧核糖核酸；血清苯丙氨酸；苯丙酮尿癥；產前診斷；PKU；PAH；基因

1、臨床資料

苯丙酮尿癥（PKU）是一種比較常見的遺傳性氨基酸代謝病，在我國人群中發病率十分低。患者由于肝臟內的苯丙氨酸羥化酶（PAH）缺乏，苯丙氨酸不能轉化為酪氨酸而在體內累積。患兒出生后若不及時得到低苯丙氨酸飲食治療，便出現不可逆轉的大腦損害和智力發育遲緩。因此認真開展PKU的產前診斷，防止PKU患兒的出生和淘汰PKU致病基因，對于保障人民健康，提高人口素質具有特別重要的意義。

1.1 一般資料。從上海收集2例PKU患者進行產前診斷，其中一例高危妊娠者年齡為30歲，另一例為28歲，均為第二胎，其妊娠周數分別為9周和17周。

1.2 PKU患兒臨床表現。PKU患兒臨床上均有智力落后、頭發變黃、皮膚白嫩、尿鼠臭味及FeCl3試驗呈現陽性。

1.3血清苯丙氨酸診斷情況。2例患者中一例血清苯丙氨酸濃度為0.90mmol/L，另一例為0.83mmol/L。

1.4 PAH與cDNA探針的準備。重組質粒phPAH247用EcoRI消化后，經瓊脂糖制備電泳分離得到2.4Kb的PAH全長cDNA，經缺口翻譯制備標記的PAH與cDNA探針。

2、方法

2.1 血清苯丙氨酸濃度測定。將PKU患兒及其雙親的血清進行分離，用LKB4400型氨基酸自動分析儀測定血清苯丙氨酸和酪氨酸濃度。

2.2 患兒和胎兒DNA的提取。（1）患兒DNA提取：采集患兒及其雙親的抗凝靜脈血，分離白細胞，按實驗室中常規方法提取高分子DNA；（2）胎兒DNA的提取：于妊娠8～10周時，在B型超聲波定位下，采集絨毛20mg左右。或于妊娠17周時，用改良的羊膜腔穿刺術采集羊水20ml，按前邊方法提取胎兒DNA。

2.3 PAH基因的限制酶位點多態性分析。患兒及其父母的DNA分別用限制性內切酶BglII、EcoRI、EcoRV、Mspl和PvuII消化，經瓊脂糖電泳，Southern印跡法轉移后，與前邊標記出的人類PAH與cDNA探針雜交和放射性自顯影，得到基因圖譜，對于PAH基因的6個酶切位點多態性進行分析，并根據這些多態性位點在患兒及其雙親的遺傳關系中，找出與缺陷PAH基因連鎖的多態性DNA片段，作為遺傳標志進行產前診斷。

2.4 胎兒的產前基因診斷。根據在限制酶位點多態性分析中找到的遺傳標志，選用合適的內切酶消化PKU高危胎兒的絨毛或羊水DNA，制作PAH基因圖譜，鑒定出胎兒是否遺傳得其雙親的缺陷PAH基因。并根據這10例孕婦于人流或分娩后所采集的胎兒臍帶血，抽取白細胞DNA，制作限制酶酶譜，來檢驗產前診斷的結果。

2.5 統計學分析研究。采用統計學軟件SPSS13.0建立數據庫，對10例苯丙酮尿癥高危胎兒患者進行t檢驗和x2查驗并進行分析，結果顯示P<0.05表示差異有統計學意義。

3、結果

3.1 血清苯丙氨酸測定。2例PKU家系的患兒血清苯丙氨酸濃度的測定結果表明，其父母結果雖然在正常值范圍內，但患兒的血清苯丙氨酸濃度均>0.73 mmol/L。因此患兒屬于苯丙酮尿癥。

3.2 限制酶位點多態性分析。通過對患兒進行PAH基因的限制性內切酶位點多態性分析，其結果表明應用內切酶分析可以完全診斷出患兒是否患苯丙酮尿癥，同時根據內切酶分析數據也可以排除胎兒患苯丙酮尿癥。

3.3 PKU產前基因診斷。2例PUK高危胎兒產前診斷選用的內切酶及產前診斷結果顯示，胎兒臍血DNA的酶譜分析結果和絨毛或羊水DNA分析結果相同，對產前診斷為非PUK的胎兒，于出生6個月后經隨訪證實產前診斷結果正確。

4、結論

人類的PAH僅存在于肝臟，PAH催化的將苯丙氨酸轉化為酪氨酸的代謝反應只局限在肝臟內進行。胎兒血、絨毛和羊水細胞內均沒有PAH的合成，無法測定其PAH活力，因此PKU的產前診斷只能通過分析胎兒的PAH基因來完成。我們應用限制酶位點多態性連鎖分析技術對2例PUK高危胎兒進行了產前基因診斷，這種多態性連鎖分析技術是目前遺傳病產前診斷最常用的技術，其關鍵是要在家系成員中，找到可作遺傳標志而能提供產前診斷信息的多態性位點。

據專家研究表明，人類DNA每100個核苷酸便有一個發生中性替代，這種替代不會造成基因表達的缺陷，但能改變限制酶的切點，因而產生相應的限制性內切酶位點的多態性。對此，我們曾經分析研究了28個中國PKU家系多態性位點，發現對中國人PKU基因診斷最有價值的是限制酶EcoRV和PvuII。這兩種酶不僅價格便宜，而且雜合的多態性比率高，因而提供基因診斷的信息多。若組合應用8個多態性位點進行連鎖分析，可對大多數（約占80%）的苯丙酮尿癥家系進行產前診斷或攜帶者檢測。但還有20%的PKU家系因沒有雜合的多態性位點，因而不能用這種多態性連鎖分析技術進行產前診斷。

據估計，人類DNA中每100個核苷酸便有一個發生中性替代，這種替代不會造成基因表達的缺陷，但能改變限制酶的切點，因而產生相應的限制性內切酶位點多態性。我們通過擴大PAH基因的限制酶酶譜分析，來發現更多的多態性位點，并將其應用于PKU的產前診斷，從而提高產前診斷的可能性。在進行產前診斷的10例PKU高危胎兒中，有5例只能作排除診斷，因為雙親中只有一方存在雜合的限制酶位點多態性。因此，隨著PAH突變基因DNA堿基替代技術的發展，應用核苷酸雜交進行PKU產前基因診斷和對攜帶者進行檢驗，具有十分廣闊的前景。

參考文獻

[1]孔祥東：《經典型苯丙酮尿癥家系8例產前診斷》，《鄭州大學學報（醫學版）》，2008年01期。

[2]宋旻等：《苯丙酮尿癥突變基因分析和產前診斷》，《中華醫學遺傳學雜志》，1995年06期。

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