氨磷汀對免疫性血小板減少性紫癜動物模型小鼠的干預作用

[摘要] 目的 探討氨磷汀對免疫性血小板減少性紫癜（ITP）動物模型小鼠血小板、脾臟系數、骨髓巨噬細胞的影響。 方法 通過獲取BALB/C 小鼠血小板抗體，接種到豚鼠身上，獲取豚鼠抗小鼠血小板抗體（APS）。將APS腹腔注射BALB/C 小鼠建立免疫性血小板減少性紫癜動物模型，使用氨磷汀腹腔注射進行治療，觀察氨磷汀對模型小鼠的血小板、脾臟系數、骨髓巨噬細胞的影響。 結果 氨磷汀給藥后均使ITP模型小鼠血小板計數上升、脾臟系數減少、骨髓成熟巨核細胞增多，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01）。 結論 氨磷汀對免疫性血小板減少性紫癜有較為明顯的治療效果。

[關鍵詞] 氨磷汀；血小板減少性紫癜；實驗研究

[中圖分類號] R554.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）14-28-03

The intervention of amifostine in idiopathic thrombocytopenic purpura mouse

ZHOU Guojian1 WANG Guiming2 CAI Xiaolian2

1.The Second People's Hospital of Zhuhai，Zhuhai 519020，China；2.Foshan Pudamei Bio-pharmaceutical Technology Company Limited，Foshan 528000，China

[Abstract] Objective To study the effect of amifostine on mice models of idiopathic thrombocytopenic purpura（ITP）. Methods Guinea pig anti mice platelet serum（GP-APS） was diluted with saline（1：4），and intravitreal injected into mice once in 2 days for 10 days.Two dosage of amifostine was intravitreal injected into mice in 10 days since mice models of ITP were established. Results Amifostine can enhance the amount of platelets，promote the mature of megakaryocyte of mice significantly and improve the histological pathology of spleen. Conclusion Amifostine is an effective and safety medicine in treating ITP， and can be used widely in clinic.

[Key words] Amifostine；Idiopathic thrombocytopenic purpura；Experimental study

免疫性血小板減少性紫癜（immunologic thrombo-cytopenic purpura，ITP）是一種以血液中血小板計數減少，骨髓中巨核細胞正常或增多，多部位、多臟器自發性出血的常見出血性疾病。其發病機制尚未完全闡明，許多資料顯示[1-2]，除體液免疫外，細胞免疫起重要的作用。目前對ITP的治療主要包括激素沖擊療法、免疫抑制、脾切除、大劑量免疫球蛋白、達那吟、干擾素及中醫藥等一些治療措施，這些治療措施均取得不同程度的治療效果，但也存在水鈉潴留、電解質紊亂、促進胃酸和胃蛋白酶分泌、升高血糖、血壓、血鉀降低、骨質疏松、骨壞死等不良反應及對造血系統有毒副作用等。氨磷汀最初作為癌癥化療、放療的輔助藥物，可以減少腫瘤化（放）療所致毒、副作用。但在應用過程中人們發現，氨磷汀不僅具有抗氧化作用，其對細胞周期、細胞凋亡、細胞分化和造血均具有調控作用。在刺激骨髓多系造血、刺激造血干/祖細胞生長、誘導巨核細胞分化、抑制骨髓基質細胞向脂肪細胞分化等方面具有作用[3]。國內也有多篇臨床研究文獻報道氨磷汀對血小板減少性紫癜有較為明顯的效果[4-5]，但未見其實驗研究報道。我們對氨磷汀治療免疫性血小板減少性紫癜模型小鼠進行研究，取得滿意的效果，研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

BALB/C小鼠，體重18～23 g，共72只，雌雄各半，SPF級，許可證號SCXK（粵）2008-002，購自廣東省醫學動物實驗中心；豚鼠，雌性，體重350 g，共8只，普通級，評可證號SCXK（粵）2008-002，購自廣東省醫學動物實驗中心。弗氏完全佐劑（北京鼎國生物技術有限公司產，DH-1341-1），弗氏不完全佐劑（北京鼎國生物技術有限公司，DH-1341-1），EDTA-Na2（天津是巴斯夫化工有限公司，分析純），烏來糖（廣東光華科技股份有限公司，分析純），草酸氨（廣東光華科技股份有限公司，分析純），氨磷汀（大連美羅大藥廠，藥用規格），潑尼松（西北第二合成制藥廠，藥用規格），瑞士染色試劑（北京博潤萊特科技有限公司，20120806）。

1.2 儀器與設備

全自動血液分析儀（法國，ABX Pentra 60），電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，BSA1245），恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司，HA-4），離心沉淀機（上海亞榮生化儀器廠，80-2），電熱恒溫干燥箱（廣州市康恒儀器有限公司，101-0A），顯微鏡（尼康儀器有限公司，nikon eclipse e100）。

1.3 豚鼠抗血小板抗血清的制備

參考文獻的方法[6-7]，取健康BALB/C小鼠，摘眼球取血，靜置半個小時，800 rmp/min離心10 min，取上層血清1500 rmp/min離心15 min，取上層血清900 rmp/min離心10 min，取上層血清3000 rmp/min離心10 min，棄去血清，得底部沉淀血小板，加入1%草酸氨1 mL，靜置5 min，3000 rmp/min離心10 min，棄去上層液體，底部血小板用生理鹽水洗滌3次，用生理鹽水稀釋到濃度為1～2×109/L，分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1混合成弗氏完全佐劑血小板抗原混合物與不弗氏完全佐劑血小板抗原混合物，備用；取健康豚鼠8只，于第1周注射弗氏完全佐劑血小板抗原混合物于其四肢、腹股溝、背部、皮下，每處注射100μL，于第2、3、4周注射同劑量的不弗氏完全佐劑血小板抗原混合物。第4周末用20%烏拉坦2 mL腹腔注射麻醉豚鼠，心臟取血。1500 rmp/min離心10 min，取上層血清，余下全血繼續3000 rmp/min離心10 min。合并2次所得血清，得豚鼠抗小鼠血小板血清APS，-20℃保存，備用。自制直徑9 cm瓊脂糖平板，用打孔器打成梅花形孔，中間孔滴加血小板懸液（500×109/L），周圍孔加1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64不同效價的豚鼠抗小鼠血小板血清。37℃溫箱孵育24 h觀察沉淀弧，檢測抗血清效價。

1.4 模型的制備及分組給藥[8-9]

取60只雌雄各半的健康BALB/C小鼠，隨機分為5組，每組12只，分別為氨磷汀高劑量組、低劑量組、模型組、正常組和陽性對照組。取出-20℃保存APS，于56℃水浴30 min滅活補體，用生理鹽水稀釋到1∶4的效價，小鼠進行腹腔注射。于0、2、4、6、8、10 d按照100μg/20 g小鼠腹腔注入稀釋的抗血清，每2天重復注射1次，以維持血小板的持續降低。

從第1次注射APS后，以120 mg/kg劑量腹腔注射作為高劑量組，以60 mg/kg劑量腹腔注射作為低劑量組，每日1次，連續給藥10 d，強的松龍組，以2.25 mg/kg劑量腹腔注射作為陽性對照組劑量組，模型組及空白對照組給予生理鹽水。

第10天給藥后2 h，摘眼球取血，檢測血小板計數；解剖取出脾臟，稱重，計算脾臟系數；剝離股骨，取出骨髓涂片，瑞士染色法，染色，計算巨核細胞的分類數。

1.5 統計學處理

應用SPSS15.0統計軟件進行統計分析，計量資料用（）的形式表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

從表1可看出，模型組血小板計數明顯降低，脾臟系數明顯升高，成熟巨噬細胞數明顯下降，與正常組比較，差異有統計學意義（P<0.01）；陽性藥物強的松龍組可明顯升高ITP模型小鼠的血小板計數、降低脾臟系數、升高成熟巨噬細胞數，與模型組比較，差異具有統計學意義（P<0.01）。氨磷汀治療各組的ITP模型小鼠血小板計數明顯升高，脾臟系數明顯下降，成熟巨噬細胞數明顯升高，與模型組比較，差異具有統計學意義（P<0.01），表明氨磷汀對免疫性血小板減少性紫癜動物模型小鼠有一定的治療作用。同時，從圖1～4的骨髓涂片可以觀察出，給藥組均可以促進模型小鼠巨核細胞成熟，從而產板巨核細胞數量增多，產生更多的血小板。

3 討論

紫癜是臨床上常見的出血癥狀之一，是由于患者體內存在抗血小板抗體。目前國內外對于紫癜的治療主要一線藥物是激素類藥物如強的松、可的松、潑尼松龍等，或是靜脈注射人免疫球蛋白和脾臟切除等。從藥理學角度看，使用激素進行治療主要通過抑制對血小板的吞噬、抑制血小板抗體的生成[10]。脾臟等免疫器官是產生血小板抗體的主要場所，通過產生血小板抗體破壞吞噬血小板，繼而激發補體系統，經過經典、非經典途徑血管外破壞血小板，導致皮下出血現象。但據臨床統計，使用激素類藥物進行治療有復發率高，副作用多，療程長等缺點，患者需長期服藥治療。據統計只有10%～20%患者停藥后沒有復發現象。使用脾臟切除治療，對于難治性紫癜20%～30%是沒有效果的[11]。對于體質弱的患者，特別是高齡患者[12]。難以長期大劑量接受激素類藥物的沖擊治療。

近年來ITP發病呈上升趨勢，因此有必要尋找高效低毒的治療藥物進行治療。氨磷汀AMF是廣譜細胞保護劑，為半胱氨酸衍生物硫磷酸鹽[13]，依賴于正常組織中的高濃度以清除自由基，它選擇性地保護正常組織，其對ITP的治療機理與激素類藥物、脾臟切除不同。氨磷汀體外對造血祖細胞生長的刺激作用已獲得肯定，國際上較為多見是將其用到MDS治療上，在研究中發現約30%骨髓增生異常綜合征的無效造血MDS患者治療后血小板水平有一定提高[4，14]。

本實驗結果也表明，氨磷汀能很好的升高ITP模型小鼠的血小板，并明顯降低ITP模型小鼠脾臟系數，促進ITP模型小鼠巨核細胞成熟，從而可以初步推測，氨磷汀治療免疫性血小板減少性紫癜可能是通過保護脾臟免疫性器官，減少血小板抗體產生，減少對血小板吞噬；同時因血小板和巨核細胞有共同抗原，減少血小板抗體產生，減少抑制骨髓巨核細胞，使其成熟無障礙，從而血小板的生成不受影響，產板巨核細胞數量增多，可產生更多的血小板。

氨磷汀治療免疫性血小板減少性紫癜的作用機制有待我們進一步進行驗證。

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（收稿日期：2013-05-09）