長鏈非編碼RNA HOTAIR在腫瘤中的研究進展

[摘要] 長鏈非編碼RNA（lncRNAs）在人類基因組普遍被轉錄且起著重要的調控作用。這類多聚腺苷酸RNA長度大于200 nt，不編碼任何蛋白質，但與腫瘤的發生發展及轉移預后密切相關。HOX 轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）全長2158個堿基，首次被發現以反式轉錄作用調控基因的表達。HOTAIR作為組蛋白修飾復合物的支架，5’端結構域結合多梳抑制復合體2（PRC2），3’端結構域結合組蛋白去甲基化酶復合體[賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）/RE1-沉默轉錄因子（REST）共阻抑蛋白（CoREST）/REST]，并介導這兩種復合體至特定基因位點，分別使染色體組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3）和組蛋白H3第4位賴氨酸去二甲基化（H3K4me2），從而使長達40 kb的堿基發生表觀遺傳學沉默。最近臨床研究表明：HOTAIR表達水平與多種腫瘤（如乳腺癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等）的發生發展及轉移預后密切相關。高表達HOTAIR能抑制抑癌基因的表達，促進腫瘤復發轉移，而下調HOTAIR表達則降低腫瘤細胞的轉移侵襲能力。盡管眾多研究表明HOTAIR與腫瘤的發生發展有密切關系，但其具體作用機制還有待進一步探究。

[關鍵詞] 長鏈非編碼RNA；HOTAIR；腫瘤

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）13-28-05

Research progress of long non-coding RNA HOTAIR in the human cancers

CAO Linping WU Jian ZHENG Shusen

Department of Hepatobiliary Surgery， First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Key Laboratory of Combined Multi-organ Transplantation of Ministry of Public Health， Hangzhou 310003， China

[Abstract] Long non-coding RNAs （lncRNAs） are pervasively transcribed and vital regulators in the human genome. These long， polyadenylated RNAs which defined as RNA>200 nucleotides in length are lack of protein-coding functions， while they demonstrate potential roles both in oncogenic and tumor suppressive pathways. HOX transcript antisense RNA （HOTAIR）， a 2158 nucleotide， spliced， was first found to have regulatory functions of reverse transcription. It may serve as a scaffold for at least two histone modification complexes. The 5' domain of HOTAIR binding Polycomb Repressive Complex 2 （PRC2） and the 3' domain binding the histone demethylase complex [LSD1 （lysine specific demethylase 1）/CoREST （Co-repressor of RE1-silencing transcription factor）/REST] can target the two complexes to the specific gene sites， resulting in histone H3 tri-methylated at lysine 27 （H3K27me3） and histone H3 dimethyl Lys4 （H3K4me2）. These lead to silence 40 kilobases of genes. Recently， clinical studies have shown a positive correlation among high expression levels of HOTAIR， subsequent metastasis， death and recurrence of many cancers， such as breast cancer， colorectal cancer， liver cancer， pancreatic cancer， laryngeal squamous cell carcinoma et al. The over-expression of HOTAIR can inhibit the expression of cancer-related suppressor genes and improve the malignant ability of tumors； contrary， down-regulation of HOTAIR can decrease the metastatic capability of many cancer cells. Although the relationship between HOTAIR and cancer has been studied， the underlying molecular mechanisms are still unclear. The function of HOTAIR related to cancer represents a major mission that should be carried out in the near future.

[Key words] Long non-coding RNA； HOTAIR； Cancer

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是指不翻譯產生蛋白質的RNA，可在多層面參與調節胚胎發育、細胞增殖分化、器官發生、劑量補償、表觀遺傳調控和基因印記等基本的生物學事件。近幾年的研究顯示，lncRNAs

在臨床上與多種腫瘤的發生和發展密切相關。HOX轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是Rinn[1]研究小組首次發現并定義。隨后的研究發現HOTAIR與多種腫瘤（乳腺癌[2]、肝癌[3-5]、結直腸癌[6]、胰腺癌[7]、胃腸間質瘤[8]、喉癌[9]、鼻咽癌[10]等）的發生發展密切相關，并可作為相關腫瘤診斷和預后判斷的一個重要標志物，也為腫瘤復發轉移治療提供潛在靶點和新的治療思路。本資料就目前的研究結果對HOTAIR可能的作用機制以及與各種腫瘤的關系做一個簡要綜述。

1 長鏈非編碼RNA概述

長鏈非編碼RNA是指長度超過200個核苷酸、無蛋白編碼功能但具有調控基因表達作用的非編碼RNA，首次在小鼠全長cDNA文庫測序中被發現。根據其在基因組中相對蛋白編碼基因的位置，將其分為[11]：（1）正義sense；（2）反義antisense；（3）雙向bidirectional；（4）內含子間intronic；（5）基因間intergenic 5種類型。相比于編碼RNA，lncRNAs序列保守性較差，但其分子內部含有一些相對高度保守的區段，正是這些相對保守的結構區段發揮其廣泛的生物學功能。近年來研究發現lncRNAs可在多個水平（轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳水平）調控基因的表達，參與物種進化、細胞分化、器官形成、胚胎發育、物質代謝等基礎生命活動和某些疾病發生發展等過程[12]。

大量臨床和實驗證據表明在腫瘤的發生發展中，lncRNAs同樣扮演著重要的角色。全基因組序列分析發現，IncRNAs中特定的超保守區段在腫瘤細胞中廣泛表達，而這類超保守區段與正常細胞的原癌基因相關，起著抑制細胞凋亡的作用，其異常表達則會導致細胞發生惡變[13]。盡管我們對lncRNAs促進腫瘤復發轉移的機制了解有限，但越來越多證據表明，lncRNAs可通過表觀遺傳（包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重構）作用導致相關基因異常表達，促使腫瘤的發生、發展和轉移等。目前研究較多的lncRNAs有HOTAIR、MALAT1、MEG3等。

2 HOTAIR概述

同源盒基因（HOX基因）最早在果蠅的同形異位現象研究中被發現，是一類在進化上高度保守的DNA序列，具有183個核苷酸保守序列（同源盒），自身編碼由61個氨基酸組成的同源結構域。其作為編碼轉錄因子的調節基因，控制胚胎干細胞的發育和分化，在胚胎發育過程中發揮重要作用。人類HOX基因分為A、B、C、D四簇，分別位于4條染色體上，每簇含有9～11個基因。研究顯示該基因發生突變會造成個體發育以及組織器官形成出現異常，甚至還可以誘發細胞發生惡變從而形成腫瘤。文獻表明，HOX基因與白血病、結直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發病均有相關性。如HOXDl0基因作為HOX基因家族成員與人類乳腺癌發生密切相關，在乳腺癌組織中其表達呈下降趨勢，可能是抑制乳腺上皮細胞發生癌變的相關基因[14]；HOXA5在乳腺癌細胞中表達水平與細胞侵襲轉移能力呈負相關，從而起到抑癌基因的作用[15]。

HOTAIR是第1個被發現以反式轉錄調控基因表達的長鏈非編碼RNA，其DNA序列位于12號染色體HOXC11基因與HOXC12基因之間，包括5個短外顯子和1個長外顯子[1]。He等[16]研究小組運用生物信息學工具對10種哺乳動物和3種非哺乳脊椎動物進行HOTAIR基因序列分析，結果發現HOTAIR外顯子1、3、4、5和6的結構域B較外顯子2和6的結構域A保守，且各外顯子基因序列存在明顯的差異；進一步研究發現，只有在哺乳動物HOXC11和HOXC12基因之間同時存在6個HOTAIR基因外顯子，但單個HOTAIR基因外顯子片段普遍存在于非哺乳脊椎動物基因組中；進化動力學研究發現同源HOTAIR基因外顯子表現出不同的進化過程，且哺乳動物中HOTAIR基因的進化過程顯著快于相鄰的HOXC基因。結構預測分析發現盡管HOTAIR序列保守性差，但外顯子1的5'端和外顯子6結構域B的3’端基因序列和結構相對保守，正是這兩個結構域可結合多梳蛋白從而發揮廣泛的生物學功能。Schorderet等[17]也發現小鼠和人類的HOTAIR結構和功能存在明顯差異。實驗證明體內敲除HOTAIR基因對小鼠HOXD基因的轉錄調節和染色質修飾影響較小，而在人類敲除HOTAIR基因可顯著改變HOXD基因的轉錄。

以上結果表明盡管HOTAIR基因序列保守性較差，同源間存在較大差異，但是HOTAIR序列中也存在發揮其生物學功能的超保守區段，這些區段可反映生物的進化過程，通過結合多梳蛋白介導相關基因的表達從而發揮生物學作用。

3 HOTAIR作用機制

LncRNAs可通過與各種染色質修飾酶相互作用來改變其構象，激活或抑制相關基因的表達從而發揮生物學功能，但具體的分子作用機制尚未闡明。HOTAIR作為lncRNAs的一員，被證實在腫瘤的發生發展中起重要作用[18-19]。

已有的文獻表明PRC2是一個作用于組蛋白H3賴氨酸第27位點K27的高度保守的組蛋白甲基轉移酶，EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是構成PRC2蛋白復合體的一個重要催化亞基，其能增強原代細胞的生長能力，與惡性腫瘤的發生發展密切相關。EZH2至少需要與兩個非催化亞基如SUZ12（suppressor of zeste 12）和EED（embryonic ectoderm development）結合形成PRC2復合體才能發揮生物學活性，但是關于其靶向特定基因的分子機制卻了解甚少。Gupta等[2]研究發現HOTAIR可結合哺乳動物多梳蛋白抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2），導致H3組蛋白第27位賴氨酸（histone H3 lysine K27，H3K27）甲基化并介導PRC2至特定位點來沉默HOXD基因座及相關抑癌基因如HOXD10、JAM2、PCDH的轉錄從而促進腫瘤的轉移復發。

隨后Tsai等[20]研究小組通過HOTAIR敲除和過表達實驗表明HOTAIR與EZH2和賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase1，LSD1）三者的相互作用是必須的。LSD1是一個黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶，只有當LSD1與RE1-沉默轉錄因子（RE1-silencing transcription factor，REST）共阻抑蛋白（Co-repressor of REST，CoREST）相互結合才能以核小體為底物使組蛋白上的H3K4me2去甲基化從而起到促癌的作用[21]。進一步的染色質免疫共沉淀-芯片（ChIP-Chip）實驗對HOX基因座和人全基因組啟動子區的PRC2和LSD1的占據情況進行分析，發現HOTAIR敲除后HOXD基因座的轉錄明顯上調，伴隨H3K4me2的占據上調和H3K27me3、LSD1和SUZ12的占據下調，全基因組啟動子中LSD1結合1395個基因，SUZ12結合4019個基因，而721個基因同時結合LSD1和SUZ12。生物信息學分析發現HOTAIR能介導LSD1復合體結合至CpG島，而SUZ12復合體能結合到標準REST基序上。當HOTAIR同時結合這兩種復合體時，能靶向介導至富含GC的基因位點上。由此得出，HOTAIR可作為組蛋白修飾復合物的支架，其5’端結構域結合PRC2，3’端結構域結合組蛋白去甲基化酶復合體[LSD1/CoREST）/REST]，并介導這兩種復合體定位至HOXD位點，分別使染色體組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3）和組蛋白H3第4位賴氨酸去二甲基化（Histone H3 Dimethyl Lys4，H3K4me2），從而使該位點長達40kb的堿基發生表觀遺傳學沉默[22-24]。

4 HOTAIR與腫瘤的關系

4.1 乳腺癌

Gupta[2]研究小組2010年最新研究在Nature雜志發表，首次提出位于HOX區域的lncRNAs（HOTAIR）在乳腺癌的進展轉移中發生了系統性的變化。通過在乳腺癌臨床標本中比較腫瘤原發灶、轉移灶和正常組織的基因表達差異，Gupta等發現HOTAIR在腫瘤原發灶及其轉移灶組織中的表達較正常對照有顯著提高，且轉移灶組織中HOTAIR普遍高表達。進一步的臨床回顧研究發現：相比于低表達患者，HOTAIR高表達患者的無轉移生存率和總體生存率均明顯降低；多因素分析顯示HOTAIR的高表達是預測病人無轉移生存率及總體生存率的危險因素之一，獨立于其他危險因素包括腫瘤大小、臨床分期和雌激素受體表達等，這充分表明HOTAIR能有效預測乳腺癌的轉移。體外研究還表明：HOTAIR的高表達能增強體外乳腺癌細胞的侵襲能力，并促進裸鼠體內腫瘤轉移灶的形成及發生；而HOTAIR表達下調能有效降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力。體外分子機制研究表明：HOTAIR與PRC2結合，促使H3K27發生三甲基化修飾，介導PRC2占據854個基因位點，包括乳腺癌抑制基因（如HOXD10、PRG1、JAM2、PCDH和EPHA1等），從而在轉錄水平抑制下游基因表達，最終增強乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力。Chisholm等[25]通過福爾馬林固定石蠟包埋臨床組織標本行RNA原位雜交發現：轉移性乳腺癌患者HOTAIR和EZH2表達水平顯著高于原發性乳腺癌患者，且兩者具有顯著相關性；臨床資料分析發現兩者共表達與患者不良預后密切相關。

相反，Lingeng等[26]在對348名原發性乳腺癌患者的研究中發現，原發性乳腺癌組織中HOTAIR表達水平及下游CpG島的甲基化具有多變性，HOTAIR表達水平和臨床及病理特征之間無顯著相關性，而多變量分析表明高表達HOTAIR的患者預后明顯優于低表達患者，提示疾病的臨床病理特征和治療情況或許會改變HOTAIR的表達水平。進一步研究指出，位于HOXC12和HOTAIR之間的CpG島發揮重要的屏障功能，其甲基化與否決定HOTAIR的轉錄水平。以上研究表明基因間DNA甲基化在調節HOTAIR的表達起著重要作用，而HOTAIR能否作為預測乳腺癌復發轉移風險的獨立危險因素還有待進一步論證。

4.2 肝癌

鑒于HOTAIR在乳腺癌中的作用，Yang等[3]對肝癌中HOTAIR的表達也進行了相關研究。定量PCR檢測發現肝癌組織中HOTAIR表達水平相比癌旁組織顯著升高，且原發病灶中HOTAIR表達水平與肝癌轉移患者的復發率和預后密切相關，超出米蘭標準的肝癌患者行肝移植術后其HOTAIR表達水平和患者預后也密切相關，提示HOTAIR可作為肝癌復發轉移的預測因子。體外實驗也發現4種肝癌細胞株（SMMC-7721、HepG2、Bel-7402和HCCLM3）其HOTAIR均呈高表達狀態，轉染下調HOTAIR的表達顯著提高腫瘤細胞對化療藥物順鉑和多柔比星的敏感性以及促進腫瘤細胞的凋亡，但具體作用機制還有待進一步研究。這不僅揭示了HOTAIR與肝癌肝移植術后復發轉移的關系，也提示HOTAIR可作為肝癌術后復發轉移治療的一個潛在新靶點。

此外，Geng等[4]通過檢測63名行手術切除治療的肝癌患者其HOTAIR的表達水平，提示肝癌組織中HOTAIR表達水平相比癌旁組織顯著升高；臨床資料分析發現HOTAIR表達水平和腫瘤淋巴結轉移存在顯著相關性，提示HOTAIR可作為腫瘤有無淋巴結轉移的獨立預測因素。鑒于基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝癌發生發展中的重要作用，設計體外實驗觀察敲除HOTAIR基因的Bel7402細胞株其MMP-9和VEGF表達水平，結果發現MMP-9和VEGF表達顯著降低，猜測HOTAIR可能通過調節兩者蛋白的表達增加腫瘤細胞的增殖能。Ishibashi等[5]通過研究也發現類似的結果，并提出HOTAIR可作為判斷肝癌患者預后的一個獨立因素，且HOTAIR可促進細胞的增殖能力。

4.3 胃腸腫瘤

Kogo[6]研究小組對結直腸腫瘤與HOTAIR之間的關系也進行了類似研究，通過定量PCR檢測100名結直腸腫瘤患者腫瘤及癌旁組織HOTAIR的表達水平提示腫瘤組織中HOTAIR表達顯著高于癌旁組織，其表達水平與患者預后呈正相關，且與腫瘤肝轉移有顯著相關性；體外實驗也表明HOTAIR高表達能顯著增加結直腸腫瘤細胞的侵襲能力；多因素分析結果進一步說明HOTAIR是預測腫瘤病人生存期的獨立危險因素；基因探針富集分析（GSEA）提示與乳腺癌類似，HOTAIR通過結合并介導PRC2至特定的基因組位點使相關基因沉默從而促進腫瘤細胞的生長。

Niinuma等[8]也發現HOTAIR過表達可增加胃腸間質瘤的轉移和侵襲能力，體外實驗也證實下調HOTAIR的表達能抑制GIST細胞的侵襲能力，說明HOTAIR不僅與上皮來源腫瘤的轉移和侵襲能力相關，而且與間質瘤的轉移侵襲也密切相關。

不僅如此，Milhem等[27]在對原發性肉瘤的研究中發現患者高表達轉移粘附基因（MTDH）和HOTAIR或許能預測腫瘤轉移的風險，進一步實驗發現HOTAIR表達水平與放化療后腫瘤細胞凋亡百分比存在相關性，凋亡百分比越高，HOTAIR表達水平越低。這表明HOTAIR不僅可預測腫瘤轉移復發的風險，還能判斷腫瘤對治療的敏感性，拓寬了HOTAIR與腫瘤的關系。

4.4 胰腺癌

多種證據表明HOTAIR與消化道腫瘤有著密切的關系，隨后Kim等[7]通過研究胰腺癌和HOTAIR的關系發現：HOTAIR在胰腺腫瘤組織中表達顯著高于癌旁組織，體外實驗也同樣證實HOTAIR在胰腺癌細胞侵襲方面起著重要作用。染色質免疫共沉淀發現，HOTAIR介導的基因抑制包括PRC2依賴（生長分化因子15，GDF15）和PRC2非依賴（干擾素調節基因IRGs，包括IL29，IL28A，IL28B和IFTM1）兩種形式，且胰腺癌細胞中HOTAIR依賴的基因抑制作用是十分復雜的，HOTAIR在胰腺癌發生發展中起著原癌基因的作用，而具體的作用機制仍有待進一步的證實。

4.5 喉癌、鼻咽癌及肺癌

越來越多的研究表明HOTAIR在多種腫瘤的發生發展中起著重要作用。Li等[9]研究小組在喉鱗狀細胞癌中也發現HOTAIR有類似的作用：喉鱗狀細胞癌組織中HOTAIR顯著高于癌旁組織，且HOTAIR可作為一個獨立的預后因素。下調HOTAIR表達可降低Hep-2細胞的侵襲性，誘導其凋亡；體外小鼠移植瘤模型發現敲除HOTAIR可抑制體內腫瘤細胞的生長。進一步的機制提示在Hep-2細胞中HOTAIR參與PTEN甲基化的調節，亞硫酸鹽測序法發現敲除HOTAIR后PTEN啟動子區域CpG甲基化明顯減少。以上表明在喉癌中HOTAIR可通過表觀修飾來調節PTEN表達沉默從而促進腫瘤生長。

Nie等[10]對160例鼻咽癌患者活檢組織行原位雜交技術分析發現91例高表達HOTAIR，并且HOTAIR表達量與腫瘤臨床分期、淋巴轉移及瘤體大小密切相關；定量PCR也提示腫瘤組織中HOTAIR表達較癌旁組織顯著升高；單變量及多變量分析均提示HOTAIR高表達患者比低表達患者預后差；體外實驗也說明HOTAIR可促進鼻咽癌細胞的遷移、侵襲和增殖。所有這些結果均提示HOTAIR可作為鼻咽癌患者預后判斷的一項新的生物學指標。最近Yan等[28]研究發現在非小細胞肺癌細胞中HOTAIR及I型膠原蛋白均顯著升高，進一步實驗表明I型膠原蛋白可調控HOTAIR的表達。

5 結論

最初的研究認為lncRNAs是基因組轉錄的“噪音”，在體內不具有生物學活性。然而，近年來lncRNAs在基因組的調控作用受到廣泛的關注與研究，極大推動了該領域的飛速發展。HOTAIR作為lncRNAs的一員，在基因組調控和腫瘤的發生發展中起著重要作用。研究表明HOTAIR可結合PRC2復合物靶向定位于HOXD位點發揮生物學功能，隨后研究發現HOTAIR可作為支架同時結合PRC2和LSD1/CoREST/REST復合體進而發揮作用。以往研究表明EZH2及LSD1在多種腫瘤中異常表達，但一直未闡明這兩種復合體的作用機制及上游調控基因。HOTAIR的研究解釋了兩者上游基因的調控作用，為其他lncRNAs的研究提供了新的思路，同時也揭示了HOTAIR與腫瘤之間的關系，提供相關腫瘤預測的指標和新的治療靶點。但是，HOTAIR在腫瘤研究中仍是一個相對未開發的領域。HOTAIR在其他腫瘤如前列腺癌、甲狀腺癌中是否和乳腺癌、肝癌一樣有類似的作用？其能否成為相關腫瘤早期診斷的分子標志物？其與相關腫瘤個體化治療是否有關？其能否作為腫瘤分子靶向治療的有效靶標？其序列中是否還存在其他能結合蛋白的結構域？此外，HOTAIR異常表達與相關腫瘤轉移復發及預后的關系仍有待進一步的實驗證明。總之，隨著對HOTAIR功能認識的不斷深入，有望包括HOTAIR在內的lncRNAs成為腫瘤復發轉移的指標以及藥物治療的新靶點。

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（收稿日期：2013-06-04）