HPLC法測定鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿含量

[摘要]目的 建立中藥鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿含量的高效液相色譜檢測方法，為中藥鉤藤中有效成分的含量測定提供科學的參考。 方法 高效液相色譜條件為：色譜柱 Phenomenex C18 （250 nm×4.0 nm， 5μm），流動相：甲醇-水（55∶45），紫外檢測波長：254 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：28℃， 進樣量：20μL。 結果 以峰面積為縱坐標濃度為橫坐標，計算得到鉤藤堿和異鉤藤堿回歸方程分別為Y=0.999 E + 6x-21 133，R2=0.9998和Y=1.008 E+ 6x-13 556，R2=0.9999。結果顯示鉤藤堿和異鉤藤堿分別在0.244～1.534 μg和0.226～1.288 μg濃度范圍內其濃度與峰面積具有良好的線性關系。另外本法在精密度、穩定性、重復性上均取得了較好結果。 結論 高效液相色譜法測定鉤藤中藤堿和異鉤藤堿含量，具有快速、簡便、重復性好的特點，值得在中藥含量測定上大力推廣應用。

[關鍵詞] 鉤藤；鉤藤堿；異鉤藤堿；含量檢測；高效液相色譜法

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）13-97-02

Study of the content determination of rhynchophylline and isorhynchophylline in Uncaria rhynchophylla by HPLC

ZHAO Xiaoli MA Yan

Henan Province Zhumadian Institute for Food and Drug Control，Zhumadian 463000，China

[Abstract] Objective Establish the HPLC method to determine the contents of rhynchophylline and isorhynchophylline in Uncaria rhynchophylla and provide scientific guidance for determining the contents of active ingredient in Uncaria rhynchophylla. Methods Contents of rhynchophylline and isorhynchophylline was measured by HPLC. Column of Diamonsi （250 nm×4.0 nm，5μm），solvent system：Methanol︰H2O（55︰45），UV wave：254 nm，Flow rate：1.0 mL/min，column temperature：28℃，Injection volume：20μL. Results We established the regression equation of rhynchophylline and isorhynchophylline Y=0.999 E+6x-21133，R2=0.9998 and Y=1.008 E+ 6x-13556，R2=0.9999，by making peak area as the ordinate and concentration as abscissa. Moreover this method got good results in precision，stability and repeatability. Conclusion The method that determining the contents of rhynchophylline and isorhynchophylline in Uncaria rhynchophylla by HPLC has the advantage on quick，simple，reproducible，and has a huge value in determining the contents of Chinese traditional Medicine.

[Key words] Uncaria rhynchophylla；Rhynchophylline；Isorhynchophylline；Content determine；HPLC

鉤藤（Uncaria rhynchophylla）是一種具有降血壓、鎮靜、抗驚厥作用的傳統中藥[1]。它屬于茜草科，主要可分為大葉鉤藤、毛鉤藤、無柄果鉤藤三大類[2]。隨著現代分離鑒定技術的進步，目前人們已從鉤藤中分離鑒定得到30多種化合物，其中生物堿為其主要的活性成分[3]。傳統的測定鉤藤中生物堿含量的方法為薄層色譜法，但是隨著現代分析技術的進步，高效液相色譜技術已成為中藥中有效成分檢測的最精確、有效的手段[4]。本研究利用高效液相色譜技術確定了鉤藤堿和異鉤藤堿在中藥鉤藤中含量的測定方法，此方法具有準確度高、重復性好、快速、簡便的優點，便于在鑒定工作中推廣應用，現將測定方法報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（大連伊利特分析儀器有限公司）；甲醇（阿拉丁股份有限公司，色譜純）；去離子水（阿拉丁股份有限公司，色譜純）；其他試劑均為分析純；鉤藤堿和異鉤藤堿對照品（上海有機藥物研究所）；中藥鉤藤（華東醫藥股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱：Diamonsil C18（150 nm×4.6 nm，5μm），流動相：甲醇-水（55∶45），紫外檢測波長：254 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：28℃，進樣量：20μL。

2.2 對照品與供試品溶液的制備

對照品制備：將5 mg鉤藤堿和異鉤藤堿對照品用甲醇溶液溶解，并用容量瓶定容至5 mL，得到鉤藤堿和異鉤藤堿的原液。再分別取20、40、80μL的原液用加甲醇分別定容到2 mL，得到溶度分別為20、40、80 μg/mL的鉤藤堿異鉤藤堿對照品。供試品制備：取鉤藤粉末2 g，放入200 mL的甲醇中浸泡24 h之后再超聲30 min，過濾得到供試液。

2.3 線性關系考察

精密量取20μL濃度分別為20、40、80μg/mL鉤藤堿、異鉤藤堿對照品進樣，并以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制其含量的HPLC標準曲線，得到鉤藤堿和異鉤藤堿的線性方程分別為Y=0.999 E + 6x-21 133，R2=0.9998和Y = 1.008 E+ 6x-13 556，R2=0.9999。結果顯示鉤藤堿和異鉤藤堿分別在0.244～1. 534 μg和0.226～1.288μg濃度范圍內其濃度與峰面積具有良好的線性關系。

2.4 實驗方法精密度、穩定性、重復性測試

精密稱取供試品溶液5次，按測定對照品線性方程的方法測定其峰面積，結果顯示中藥鉤藤提取液的峰面積RSD為1.15%，這表明本次實驗所用的高效液相其精密度良好。之后再取鉤藤提取液樣品每次間隔2 h按上述方法進樣，得到RSD的值為0.84%，表明本實驗所用的測定方法具有穩定性。取同一批次鉤藤供試品按進樣并測定其含量，結果顯示鉤藤堿和異構堿的含量比分別為1.352% 和1.547%，RSD值為1.18%，表明測定方法重復性良好。

2.5 鉤藤、異鉤藤含量測定

取9份鉤藤供試品，每份20μL，每次3份，分3次進樣，測定異鉤藤堿、鉤藤堿信號值，并將其分別代入線性回歸方程，得出中藥鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的含量分別為1.352% 和1.547%。

2.6 提取方法的優化

取中藥鉤藤20 g，分別用等量200 mL的乙醚、乙醇、甲醇、氯仿進行浸提。浸提24 h后，再對樣品進行超聲震蕩30 min，之后對其過濾，并分別取20μL的供試品進樣，測定其不同提取方法下中藥鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的含量。測試結果表明，甲醇提取液中鉤藤和異鉤藤堿的含量最高，其含量分別高達1.352%和1.547%，其值與其他溶劑組相比，在統計學上具有顯著性差異（P<0.05）。結果見表1。

2.7 統計學處理

實驗數據均采用SPSS15.0與DPS7.0統計軟件包聯合統計，資料符合正態性及方差齊性檢驗采用單因素方差One-way ANOVA分析，文中計數資料采用x2檢驗，統計學差異為P<0.05。

3 討論

本研究中建立的中藥鉤藤中鉤藤和異鉤藤堿含量的高效液相色譜測定法具有精確度、穩定性高、重復性好、簡潔、快速的特點，這為之后中藥中有效成分的含量測定提供了有效的參考依據。對于浸提溶劑的優化，本研究分別選用了乙醚、乙醇、甲醇、氯仿對中藥鉤藤進行浸提，結果顯示用甲醇做溶劑，得到的鉤藤堿（1.352%）和異鉤藤堿（1.547%）的含量遠遠高于其他溶劑，并且具有顯著性差異（P<0.05）。因此甲醇為提取鉤藤中生物堿的最佳溶劑。此外本研究還對提取時間和超聲的時間進行了分析研究，發現浸提24 h，超聲30 min為最佳的提取時間。流動相的選擇本研究在參考文獻的基礎上進行了多次預實驗[5-6]，發現甲醇-水（55∶45）為最佳流動相。檢測波長的選擇，本研究分別對兩種照品溶液進行了不同波長下的紫外分光光度法檢測，掃描結果顯示鉤藤堿和異鉤藤堿在254 nm波長下具有最大的紫外吸收，因此本研究選定254 nm為本研究的紫外檢測波長。本研究建立的中藥鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿含量的高效液相色譜法具有快速、簡便、精確的特點，值得在實際的中藥檢測中進行大力推廣。

[參考文獻]

[1] 胡曉波.復方杜仲片中鉤藤的鑒定及其鉤藤堿的含量測定[J].中成藥，2011，12 （9）：13.

[2] 王曉穎，劉永靜，陳丹，等.HPLC法測定不同產地鉤藤中鉤藤堿的含量分析[J].中國中醫藥科技，2011，5（11）：115-117.

[3] 仲云，馮瑞芝.鉤藤及其同屬植物生物堿含量的紫外分光HPLC測定[J].中草藥，2011，24（9）：462-465.

[4] 李思蒙，侴桂新.鉤藤藥材中異鉤藤堿含量的超高效液相色譜和高效液相色譜法測定[J].時珍國醫國藥，2012，13（5）：104-106.

[5] 王英鋒，魏璐雪，王保中.高效液相色譜法測定鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿含量[J].藥物分析雜志，2009，16：56-59.

[6] 鄭嘉寧，王定勇.大葉鉤藤生物堿類化學成分研究[J].中醫藥導報，2009，15（1）：18.

（收稿日期：2013-05-07）