Daxx反義寡核苷酸在全腦缺血/再灌損傷中作用機制的研究

摘要：目的 檢測Daxx反義寡核苷酸在大鼠海馬全腦缺血/再灌介導的神經元損傷中作用機制的研究。方法 采用SD大鼠四動脈結扎全腦缺血模型，于缺血前連續3d腦室注射Daxx反義寡核苷酸，用免疫印跡方法研究Daxx反義寡核苷酸在大鼠海馬全腦缺血/再灌介導的神經元損傷中對Daxx/Ask1信號通路的影響。結果 在海馬的CA1區，Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制腦缺血介導的Daxx的核轉位以及Ask1磷酸化的升高。結論 缺血前3d連續腦室注射Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制Daxx/Ask1介導細胞信號轉導通路。

關鍵詞：腦缺血/再灌；反義寡核苷酸；Daxx；Ask1

腦血管疾病是神經系統的常見病，因此研究其發病的分子機制具有極其重要的意義[1]。死亡結構域相關蛋白（death domain associated protein， Daxx）在核內作為轉錄調控子發揮促凋亡作用[2]，在各種凋亡刺激下，Daxx可以從胞核轉移到胞漿中，從而啟動不同的細胞信號轉導通路引起細胞的凋亡。

凋亡信號調節激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）是MAPKKK家族中的一個成員，可以分別激活MKK4/7-JNK和MKK3/6- p38信號通路[3-5]而引起細胞的凋亡。在腦缺血信號轉導中ASK1信號級聯反應是重要的致凋亡信號通路[6-8]。

1 資料和方法

1.1一般資料 雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，250～300g，清潔級，由徐州醫學院實驗動物中心和中科院上海實驗動物中心提供。

1.2 SD大鼠腦缺血/再灌模型的建立 按本室已建立的大鼠四動脈結扎全腦缺血模型，實驗動物有機分為假手術組、缺血/再灌組、溶劑對照組和給藥組。動物以20%水合氯醛（300～350mg/kg）腹腔注射麻醉后，分離雙側頸總動脈并電凝椎動脈。手術第2d動物于清醒狀態下結扎雙側頸總動脈，使全腦缺血15min，然后再灌注不同時間。

1.3 數據處理 數據以均數±標準差（x±s）表示，統計分析采用方差分析（ANOVA），實驗組之間比較采用Sigma Stat統計軟件，P<0.05為統計學差異有顯著性。

2 實驗結果

2.1 Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制腦缺血/再灌介導的海馬CA1區Daxx蛋白在胞漿中的表達 生理情況下，Daxx主要存在于細胞核內，在各種凋亡刺激下，Daxx出核轉位到胞漿內。以前的研究結果表明Daxx在胞漿內的表達在缺血復灌后明顯升高，分別在復灌3h和3d達到高峰。我們選擇腦缺血復灌后3h的海馬CA1區細胞漿部分來檢測Daxx反義寡核苷酸對Daxx蛋白表達的影響。發現Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制CA1區胞漿內Daxx表達的升高。而溶劑對照和Daxx錯義寡核苷酸組對其沒有影響（如圖1）。

2.2 Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制腦缺血再灌早期ASK1-Thr845的磷酸化 既然Daxx反義寡核苷酸能夠抑制Daxx的核轉位，那么它對下游激酶ASK1是否也有作用？我們以前的結果顯示在腦缺血/復灌刺激后海馬CAI區ASK1的磷酸化逐漸升高，并形成兩個活化高峰，分別在復灌3h和3d[9]。我們選擇復灌3h的海馬組織為研究對象檢查藥物對ASK1的影響。與溶劑對照組和錯義寡核苷酸組相比，Daxx反義寡核苷酸可以使ASK1-Thr845的磷酸化顯著降低，而ASK1的蛋白表達沒有受到影響（如圖2）。

3 討論

Daxx最初是被作為Fas相互作用蛋白而被發現的[10]。Fas的活化誘導Daxx和ASK1之間的相互作用，Daxx抑制ASK1分子內氨基末端和羧基末端的相互作用，激活ASK1，從而活化JNK通路.在本實驗中，我們首先通過免疫印跡方法來檢測在大鼠海馬CA1區胞漿內全腦缺血復灌過程中Daxx的表達。結果顯示，Daxx蛋白在胞漿內的表達在全腦缺血復灌后明顯升高。我們接著檢測Ask1在全腦缺血復灌過程中的蛋白表達和磷酸化的變化。結果表明，缺血/復灌后ASK1的磷酸化逐漸升高，但蛋白表達沒有明顯變化。那么Daxx的核轉位與Ask1之間究竟有什么聯系呢？帶著這個疑問，我們在缺血前連續3d腦室注射Daxx反義寡核苷酸來檢測Daxx與Ask1之間的關系。我們驚喜的發現Daxx反義寡核苷酸可以明顯的抑制Daxx的核轉位以及Ask1磷酸化的升高，相反，Daxx錯義寡核苷酸組以及容積對照組對其沒有影響。說明，在大鼠海馬CA1區全腦缺血復灌過程中可以引起Daxx從胞核到胞漿的轉位，并進一步引起Ask1的磷酸化，而Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制這一過程的進行，最終抑制Daxx-Ask1所介導的細胞凋亡信號轉導通路，這對我們今后進一步研究Daxx在大鼠海馬全腦缺血復灌過程中的作用具有重要的意義。

參考文獻：

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編輯/王敏