兔膝骨關節炎軟骨細胞體外培養體會

摘要：骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨進行性退變病變慢性疾病，近些年發病率在不斷增高。基礎研究主要有各種原因引起的細胞數量過少而無法開展下去。在建立動物模型的基礎上更有效的提取軟骨細胞、體外培養對基礎研究做出最基本鋪墊，為臨床治療提供更有效的理論依據。本文通過軟骨的提取、軟骨的消化、細胞的收集、培養、鑒定，結合國內外文獻做一綜述。

關鍵詞：骨關節炎；軟骨細胞；體外培養

軟骨組織﹙cartilage）由軟骨細胞﹙chondrocyte）和細胞外基質﹙extracellularmatrix， ECM﹚構成，軟骨細胞是關節軟骨主要構成成分，主要功能是合成、分泌軟骨基質，維持軟骨組織新陳代謝，是軟骨破壞過程中的靶細胞，因此軟骨細胞的體外培養是研究關節軟骨生理及病理的常用體外實驗模型，尤其是骨關節炎軟骨細胞的提取在研究治療骨關節炎、最基本最關鍵的一步[1]。自從1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和細菌膠原酶聯合消化法獲得了高純度的軟骨細胞以來，為了獲得數量較多的軟骨細胞，軟骨細胞的提取、培養、傳代、鑒定，等不斷改進。但不同的動物，不同的模型對軟骨細胞的提取也有一定的不同。本文通過對兔膝骨關節炎造模成功后提取軟骨細胞進行培養、傳代、鑒定進一步認識兔膝骨關節炎軟骨細胞體外培養的要點及關鍵問題等。

1軟骨的提取

將實驗兔用空氣栓塞法處死，沿右膝關節正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關節為中心約6 cm×6 cm的區域，浸泡于75%的酒精中20～30 min，放入超凈臺中打開膝關節腔，無菌條件下用11號刀片（帶柄）削取膝關節股骨髁和脛骨平臺軟骨組織，將獲得關節軟骨組織，置入盛有含青霉素鈉/鏈霉素雙抗液 （1×1010U/L）的D-hanks液的無菌平皿中，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍，用眼科剪將軟骨組織剪成1mm3小塊，見圖1，然后再用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍。

在軟骨的提取過程中首先必須在無菌的條件下打開關節削取軟骨，我們總會最大量的削取更多的軟骨使得提取更多軟骨細胞，但更要主要的是①避免削取軟骨以外的組織，避免細胞提取還有其他組織細胞；②削取軟骨時不要削的太厚，可以一層層的削，這樣可以有助于軟骨的消化；③削取完后軟骨組織必須剪成1 m3小塊，有助于軟骨的消化，用緩沖液多清洗幾遍更好地去除血液、脂肪組織等其他組織。

2軟骨的消化

用0.25%胰蛋白酶先消化30～35 min，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍；加入0.2%Ⅱ型膠原酶（DMEM配制），置于37℃，體積分數5%CO2培養箱中培養消化100 min，每30 min置37℃恒溫振蕩箱振蕩5 min。后抽取上清液用200目不銹鋼篩網過濾入離心管，800 r/min離心4min棄上清，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗兩遍每次800 r/min離心4min棄上清去除膠原酶。加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。用槍輕輕吹打可獲得單個軟骨細胞懸液。將軟骨細胞按1×105/L濃度接種于10 mL培養皿中，置于37℃，體積分數5%CO2培養箱中培養。培養皿中剩余的軟骨加入1%Ⅱ型膠原酶（DMEM配制） 置于37℃，體積分數5%CO2培養箱中培養消化，每1 h置37℃恒溫振蕩箱振蕩5 min。倒置顯微鏡下觀察，軟骨細胞大部分分離后，用200目不銹鋼篩網過濾入離心管，800 r/min離心4 min棄上清，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗2遍800 r/min/次，離心4 min棄上清去除膠原酶。加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。用槍輕輕吹打可獲得單個軟骨細胞懸液。將軟骨細胞按1×105/L濃度接種于10 mL培養皿中，置于37℃，體積分數5%CO2培養箱中培養。待細胞貼壁達到85%～90%后傳代。

很多文獻中軟骨細胞消化都在3～6 h，然而軟骨細胞的消化時間要大大縮短，這也是兔膝骨關節炎模型的一個弊端，因為兔子的軟骨細胞消化時間過長越長細胞損傷越厲害，雖然有時我們在細胞計數時看到的都是活細胞，但放到培養瓶里樣上兩天基本上沒有貼壁的，軟骨細胞也是一種群居生活的物種，貼壁細胞越少增值能力越低。

3細胞的傳代及培養

軟骨細胞培養方法很多，包括單層培養法、三維培養法、離心管培養法、生物反應器等。其中單層培養法、三維培養法用的比較多，因三維培養法需要付出昂貴的費用本實驗采用單層培養法來培養兔膝骨關節炎軟骨細胞。軟骨細胞呈貼壁生長后，隨傳代次數增加，軟骨細胞發生去分化現象，限制了軟骨細胞的大量擴增。其中應該注意的是提取軟骨細胞時應用含12%～13%FBS培養基進行培養，從第二代細胞開始改用含10%FBS培養基進行培養，每3 d換液1次，細胞融合并覆蓋瓶底>80%時，用0.25%胰蛋白酶﹙含0.02%EDTA﹚消化，進行傳代培養。主要是因為開始時用含12%～13%FBS培養基進行培養是因為可以使細胞更容易貼壁，而后改為含10% FBS培養基進行培養是為了防止細胞早期就會出現\"去分化\"現象。實驗一般選用第三第四代細胞，其活性與增值能力最強。

細胞傳代時應注意的是胰蛋白酶消化時間不要過程，室溫一般30～60 s或用0.1%的胰蛋白酶。盡可能的減少細胞的損失。細胞離心600轉5 min，用槍吹打細胞時用力不要過猛。傳代后細胞損傷嚴重時主要表現是細胞增值能力下降或出現\"去分化\"現象，細胞的\"去分化\"現象主要表現在細胞的形態與分泌，細胞從多呈三角形、長梭形或多角形向圓形改變，分泌的Ⅱ型膠原以及蛋白多糖減少。

5細胞的鑒定

5.1軟骨細胞形態學觀察 在倒置顯微鏡下觀察，剛接種的軟骨細胞呈球形，24～48 h后開始貼壁生長，細胞多呈三角形、長梭形或多角形，72 h后細胞開始增殖，單層生長，彼此不相接觸。細胞增長至爬滿瓶底時軟骨細胞可變為圓形，胞體豐滿，胞漿均勻，核大而圓并且互相連接成\"鋪路石\"樣結構。蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色可見軟骨細胞呈三角形或多角形，細胞核呈紫藍色，可見明顯的雙核仁或多核仁形態，細胞基質紅染，胞漿及細胞周圍有紫紅色或紅色異染出現[3]。

5.2Ⅱ型膠原蛋白 Ⅱ型膠原的合成和分泌是軟骨細胞維持其分化表型的特征性指標，可通過Ⅱ型膠原免疫熒光染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色來鑒定。Ⅱ型膠原免疫熒光染色﹙異硫氰酸熒光素FITC﹚可見胞漿和胞膜呈清晰綠色熒光，細胞核區域未見明顯綠色熒光，證明軟骨細胞特征性Ⅱ型膠原主要分布在胞漿和細胞膜上。Ⅱ型膠原免疫組化染色可見軟骨細胞胞漿被染成棕黃色，胞核不著色，胞外基質中也有棕黃色顆粒出現[4]。

5.3蛋白聚糖蛋 白聚糖是軟骨細胞分泌的基質成分，是軟骨細胞功能的主要指標，可通過甲苯胺蘭染色和阿利新藍﹙Alcianblue﹚染色進行鑒定。甲苯胺蘭染色可見軟骨細胞呈紫藍色，細胞基質呈藍色，軟骨細胞內及細胞周圍有藍紫色異染顆粒；阿利新藍染色可見軟骨細胞胞漿和胞膜呈深藍色，證明培養軟骨細胞分泌和合成蛋白聚糖[5]。

5.4 IL-1，TNF-α、MMP-13在細胞內以及分泌表達在ELRSA試劑盒。

6展望

軟骨是一種特殊類型的結締組織，由軟骨細胞、軟骨基質和纖維構成。軟骨細胞的功能為合成細胞外基質大分子及各種酶類，而軟骨細胞外基質主要有膠原和蛋白多糖聚集體組成。膠原中有間質型膠原I、Ⅱ和Ⅲ，且Ⅱ型膠原為軟骨細胞的基因表達產物可用來確定軟骨細胞的表型[6]。

1965年Chesterman和Smith首次利用體外培養的軟骨細胞修復松質骨和關節軟骨缺損，近30年來軟骨細胞體外培養在方法學上也取得了很大進 展[7]。軟骨細胞經過培養所形成的結節樣結構，具有關節軟骨的生物學特征。軟骨細胞體外培養的方法是從細胞水平來探索關節軟骨生物學特性，為研究關節軟骨疾病的發病原理及其治療方法（包括藥物治療）提供了有效而簡便的方法。以細胞體外培養技術為基礎，在體外將軟骨細胞進行定向誘導分化，調節細胞的增殖及凋亡等方面的研究，有助于研究治療某些退行性疾病的藥物，因此具有廣闊的應用前景。

因骨性關節炎軟骨細胞處于退變期，細胞周期較正常軟骨細胞周期要短，其可能原因： 骨性關節炎軟骨細胞為變性軟骨細胞，細胞功能的改變可能影響細胞周期的變化[8]。損傷的骨性關節炎軟骨中，軟骨細胞代謝活躍，相伴隨的細胞分泌的各種胞外基質也相應高表達，軟骨代謝的異常，導致胞外基質成分的異常，軟骨細胞生存環境改變促使軟骨細胞過早的死亡，加劇骨性關節炎的進程；骨性關節炎軟骨細胞中混雜有纖維軟骨細胞，纖維軟骨細胞增殖速度明顯較軟骨細胞快，必將影響細胞周期的變化[9-10]。

體外培養軟骨細胞是研究軟骨分化、增殖以及軟骨病變的一種常用模型，也是軟骨組織工程的基礎。目前體外軟骨細胞的培養技術已經日漸成熟，可從許多動物及人的不同軟骨組織中分離培養軟骨細胞，但是軟骨細胞的體外培養方法均存在一定的局限性，培養條件還有待進一步完善。另外，軟骨細胞分化、增殖過程中受到多種調控因子的調控，其相互作用機制復雜，對軟骨細胞體外培養的影響還有待進一步的深入研究。

參考文獻：

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編輯/張燕