應用沉淀法消除HLAP患者生化標本乳糜狀態的探討

張輝亮，黃樹華，劉健玲，夏厚才

(廣州市南沙區第六人民醫院檢驗科，廣東廣州511470)

高脂血癥是導致高脂血癥性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP)的病因之一，但同時高脂血癥也是HLAP代謝異常的表現[1-2]。HLAP患者由于胰腺功能受損，脂肪代謝障礙，在發病期間血脂急劇升高，極大地加重了血液中脂肪的含量[3]，使患者血清外觀呈牛奶樣極度渾濁狀態，即通常所說的重度乳糜血，極大地干擾了生化檢驗的比色和比濁法測定，在生化分析儀上顯示“ABS(吸光度異常)”報警信息或者甚至為負值，無法完成項目的測試。平時遇到此類重度乳糜標本一般都以“標本不合格”的理由退回或者建議素食若干天后重抽血。但HLAP患者標本不同于普通的高脂血癥標本。急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種急腹癥，病情危急，嚴重者甚至會休克或死亡[4]，臨床上迫切需要掌握相關的檢驗項目數據以便能及時進行診治。針對這種情況，我們以磷鎢酸鎂作為去除血脂的沉淀劑，探索和確立了一套能消除HLAP患者標本乳糜狀態并準確進行主要生化項目檢測的可靠方法。

材料和方法

一、材料

1.標本來源 實驗所用標本均來自廣州市南沙區第六人民醫院門診或住院患者生化檢驗標本。外觀正常的標本即肉眼觀察非溶血、非黃疸和非脂血的標本。37例 HLAP患者標本來自2011年10月至2013年6月經廣州市南沙區第六人民醫院確診的HLAP患者。HLAP診斷標準參照“中國急性胰腺炎診治指南”標準[5]:具備AP的臨床表現和生化改變，且Ranson評分≥3;CT分級 D或 E;APACHEⅡ評分≥8;甘油三酯(triglyceride，TG)＞11.3 mmol/L 或 TG 為 5.65～11.3 mmol/L且血清呈乳狀;排除AP的其他致病因素如膽道結石、微結石、Oddi括約肌功能障礙、藥物性AP、細菌病毒感染等。

2.檢驗項目 項目為除血脂外的常規生化檢驗項目，包括鉀離子(K+)、鈉離子(Na+)、氯離子(Cl-)、鈣離子(Ca2+)、二氧化碳結合力(CO2combining power，CO2CP)、血糖(glucose，Glu)、尿素(Urea)、尿酸(uric acid，UA)、肌酐(creatinine，Cr)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 C(cystatin C，Cys C)、淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、γ-谷氨酰基轉移酶(gamma-glutamyltranspeptidase，GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，Alb)、總膽紅素(totalbilirubin，TBil)、直接膽紅素 (direct bilirubin，DBil)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LD)、乳酸脫氫酶同工酶1(lactate dehydrogenase 1，LD-1)、α-羥丁酸脫氫酶(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH)、高敏C反應蛋白(high-sensitive C reactive protein，hs-CRP)。

3.儀器與試劑 儀器為TOSHIBA-120FR全自動生化分析儀。K+、Na+、Cl-試劑由日本東芝株式會社生產;Ca2+、Glu、Urea、UA、ALT、AST、GGT、ALP、TP、Alb、TBil、DBil、CK、LD、α-HBDH、CK-MB試劑由中生北控生物科技股份有限公司生產;Cr、TBA、CO2CP、LD-1試劑由日本積水化學工業株式會社生產;AMY、CHE試劑由北京利德曼生化股份有限公司生產;Cys C、hs-CRP試劑由英國RANDOX實驗診斷有限公司生產。脂肪乳液為廣州百特僑光醫療用品有限公司生產的中/長鏈脂肪乳注射液(C8-24)。沉淀劑磷鎢酸鎂為中生北控生物科技股份有限公司生產的沉淀法高密度脂蛋白膽固醇試劑盒配套的沉淀劑。質控品為RANDOX復合質控品level-2和level-3，批號分別為741UN和539UE。

二、方法

1.相關性分析 取外觀正常的臨床標本血清20支，以1∶1的比例與磷鎢酸鎂試劑混合，靜置5 min后以2 600×g離心10 min，對上清液進行上述常規生化項目檢測，將測量數值乘以稀釋倍數2作為最終結果;同時此20支臨床標本血清原液亦進行相同的生化項目檢測。對各生化項目兩組數據進行相關性分析，得出散點圖、擬合曲線圖及相關系數、判定系數、回歸方程等參數。

2.回收試驗 用脂肪乳液與蒸餾水混合配制成TG含量大約為20、80、160 mmol/L的低、中、高3個濃度的乳液備用。取外觀正常的臨床標本血清20支做上述常規生化項目檢測，然后每支血清取3份分別與配制好的乳液等比例混合，模擬成輕、中、重3種不同程度的乳糜血清(TG最終濃度分別為10、40、80 mmol/L)，再與磷鎢酸鎂試劑1∶1混合，其余操作同上，對上清液或下清液進行相同生化項目檢測，將測量數值經回歸方程轉換，再乘以相應的稀釋倍數作為最終結果，與原始結果進行比較，計算各生化項目的回收率。

3.HLAP患者標本實證試驗 HLAP患者標本首先用稀釋法測定TG濃度，再根據TG濃度作適當處理后與磷鎢酸鎂試劑1∶1混合，其余操作步驟同上。

三、統計學方法

用EXCEL2007表格處理初始數據并進行均值、回收率的計算;用SPSS 18.0軟件Regression(回歸)菜單下的 Curve Estimation(曲線估計)和Linear(線性)2個功能進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、相關性分析

經磷鎢酸鎂試劑處理后的血清標本能正確檢測的生化項目有 K+、Na+、Cl-、Ca2+、Glu、Urea、UA、Cr、AMY、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、TP、Alb、TBA、CK、LD、α-HBDH;不能正確檢測，即測定結果等于零、趨于零或負值的生化項目有 CO2CP、TBil、DBil、CK-MB、LD-1、Cys C、hs-CRP。

散點圖及擬合曲線圖以K+作為代表，見圖1。擬合曲線圖除了 Na+、Cl-、Ca2+在坐標軸上有較明顯的截距外，其余項目曲線均通過原點或近似通過原點。

能正確檢測的生化項目回歸系數b除Na+、Cl-外其余均趨于“1”;相關系數(r)除 Na+、Cl-、Ca2+外其余均 ＞0.99，Na+、Cl-、Ca2+的 r＞0.90;判定系數(R2)除 Na+、Cl-、Ca2+外其余均 ＞0.98，Na+、Cl-、Ca2+的 R2＞0.80;擬合曲線顯著性檢驗P均＜0.01。見表1。

圖1 K+經磷鎢酸鎂處理前、后檢測值的擬合曲線圖

二、回收試驗

輕、中、重3組模擬乳糜血清標本經磷鎢酸鎂處理后其中輕度乳液析出物沉淀，上清液澄清;中度和重度乳液析出物上浮，下清液澄清。各生化項目的平均回收率最低為 98.03%，最高為103.44%，均在95% ～105%之間。見表2。

表2 3組模擬乳糜血清標本經磷鎢酸鎂處理后各生化項目的回收率(n=20)

三、HLAP患者標本實證試驗

37例HLAP患者標本中TG＜10 mmol/L有3例、10～40 mmol/L有26例、＞40 mmol/L有8例(其中有2例超過了100 mmol/L)。乳糜去除效果:TG＜10 mmol/L的標本與磷鎢酸鎂混合后沉淀效果顯著，上清液清澈透明。TG＞40 mmol/L的標本析出物不沉淀反而上浮，下清液亦清澈透明。TG為10～40 mmol/L的標本析出物部分沉淀或上浮，上清液渾濁，乳糜去除效果不甚理想。若先作適當的倍比稀釋，使TG＜10 mmol/L再與磷鎢酸鎂等比例混合即可達到完全沉淀的效果。見表3。37例HLAP患者標本經過磷鎢酸鎂處理后取上清液或下清液進行生化項目檢測。能順利檢測的生化項目包括K+、Na+、Cl-、Ca2+、Glu、Urea、UA、Cr、AMY、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、TP、Alb、TBA、CK、LD、α-HBDH;無法檢測的生化項目有 CO2CP、TBil、DBil、CK-MB、LD-1、Cys C、hs-CRP。磷鎢酸鎂對生化項目檢測的影響與相關性分析試驗中的影響是一致的。

表3 37例HLAP患者標本實證試驗乳糜去除效果

討 論

HLAP多見于Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ型高脂血癥患者，上述型別脂血癥患者標本的特點是血清中懸浮著大量影響濁度的乳糜微粒和極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)。乳糜微粒和VLDL均含有豐富的TG。因此，臨床上把TG濃度作為HLAP的診斷依據[1，5-7]。本研究結果顯示大多數HLAP患者的TG濃度為10～40 mmol/L，個別甚至超過了100 mmol/L，TG濃度往往比普通高脂血癥患者或餐后一過性高血脂患者高出十幾倍甚至幾十倍。如此渾濁的乳糜標本對以透射光為主要檢測原理的生化檢驗造成了極大的影響[8]，常用的消除本底干擾的稀釋法與雙試劑兩點法只適用于輕度的脂血標本[9-10]，并不能消除HLAP患者標本重度乳糜所帶來的干擾。

很多文獻報道了各種去除血脂的方法，如4℃冰箱過夜法、超速離心法、乙醚抽提法、聚乙二醇沉淀法、磷鎢酸鎂沉淀法等。4℃冰箱過夜法操作簡單，但不能徹底消除乳糜的干擾，且檢驗時間過長，不適用于HLAP急診檢驗，標本長時間存放也會導致檢驗結果不準確;超速離心法對生化反應影響最小，能去除大部分乳糜，但不徹底[11]，且超速離心會使部分血清成分特別是大分子物質(如蛋白質等)分布不均勻而影響結果的準確性，另外超速離心機常見于科研機構，一般醫院很少配備，限制了其使用;乙醚抽提法易使蛋白質酶類發生變性，影響蛋白質和酶類的檢測[12]，且乙醚具有易燃、易爆、易揮發和神經麻醉的特性，對環境及操作人員會構成一定的安全隱患;聚乙二醇結構復雜，從 PEG-200到 PEG-20000不等，沉淀效果千差萬別，且對于高脂血癥標本，其重復性較差，另外還會隨著加入濃度的不同而影響不同的試驗[13];磷鎢酸鎂沉淀法雖然也會影響部分試驗的檢測，但其清除血脂徹底，產物結構穩定，是中華醫學會檢驗分會作為沉淀法檢測高密度脂蛋白膽固醇(high-densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)推薦使用的理想沉淀試劑[14]。

磷鎢酸鎂作為沉淀劑檢測HDL-C的原理為多聚陰離子與二價金屬離子共同作用，與血清中的載脂蛋白B(apolipoprotein B，apo B)形成不溶性的復合物。因此，磷鎢酸鎂可選擇性沉淀含apo B的乳糜微粒、VLDL、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)和脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]，前者含 apo B48，后三者含 apo B100，血清脂蛋白中僅剩余不含apo B的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)即可單獨檢測[15]。本研究的實驗設計正是利用磷鎢酸鎂能夠沉淀去除乳糜微粒和VLDL的原理而達到消除血清乳糜狀態的目的。

通過對外觀正常的標本經磷鎢酸鎂處理前后常規生化檢驗項目的分析顯示，除了CO2CP、膽紅素、同工酶類、血脂類和比濁法的試驗外，絕大多數的生化項目經磷鎢酸鎂處理后均可正確檢測，且與處理前有非常好的相關性，擬合曲線分析顯示兩者呈顯著的直線相關，利用直線回歸方程可建立它們之間的關系。從各生化項目的散點圖和擬合曲線圖上可看出，擬合曲線圖除了Na+、Cl-、Ca2+在坐標軸上有較明顯的截距外，其余項目曲線均通過原點或近似通過原點。另外，除了Na+、Cl-外其余項目回歸方程的回歸系數均趨于“1”。因此，在實際應用中，除了 Na+、Cl-、Ca2+之外，其他項目的回歸方程可近似地把截距看作是“0”而把回歸系數看作是“1”，這樣方程就可以簡化成“Y=X”，也就是標本經磷鎢酸鎂處理后以上這些檢測結果只需乘以稀釋倍數即可，磷鎢酸鎂對這些生化反應不會產生干擾。當然，如果各實驗室能制訂出適合本實驗室使用的回歸方程，通過方程計算出最終結果會更加準確、可靠。

由于外觀正常標本與乳糜狀態標本存在著較大的差異，磷鎢酸鎂在乳糜狀態下對生化檢驗項目的干擾不一定與外觀正常標本相同，因此本研究設計了輕、中、重3類模擬乳糜血清標本并對其做各項目的回收試驗。結果顯示，相關性分析試驗中具有直線相關的所有生化項目其回收試驗數據經回歸方程轉換后回收率均介于95%～105%之間，具有良好的回收效果，無論標本是否為乳糜狀態，磷鎢酸鎂對生化項目檢測的干擾是恒定的。

模擬乳糜血清由于加入的脂肪乳液成分單一，僅含中長鏈的TG，不含膽固醇，與真正的乳糜標本有一定的差別。為了證實磷鎢酸鎂對真正HLAP患者標本的處理效果，本研究收集了37例HLAP患者血清標本做實證試驗。結果顯示磷鎢酸鎂沉淀血脂的最適范圍為 TG＜10 mmol/L。TG＞40 mmol/L的標本的析出物反而上浮(回收試驗中中度和重度乳液血清析出物也上浮)，可能是由于此類標本血脂絕大部分的成分為TG所致;而TG濃度為10～40 mmol/L之間的標本血脂成分相對復雜，且含量又超出了磷鎢酸鎂的沉淀能力，因此需做一定的倍比稀釋，使 TG＜10 mmol/L后才能徹底清除血脂。從實證試驗可得出TG＜10 mmol/L和TG＞40 mmol/L的標本與磷鎢酸鎂溶液等比例混合離心，前者取上清液、后者取下清液可以進行常規生化項目的檢測;TG在10～40 mmol/L之間的標本先做倍比稀釋，使TG＜10 mmol/L后再與磷鎢酸鎂溶液等比例混合離心，取上清液進行檢測。原液無法檢驗的HLAP患者標本經磷鎢酸鎂處理后能正確進行絕大部分生化檢測，受影響的項目與外觀正常標本相關性分析試驗中的一致。

綜上所述，磷鎢酸鎂沉淀法能有效消除HLAP患者標本的嚴重乳糜狀態，并對絕大多數的生化項目不會產生干擾，試驗操作簡單、快捷，沉淀效果顯著，試劑來源便利，不需要任何特殊的設備，成本低廉，適合所有醫院的實驗室，是HLAP患者標本以及其他乳糜標本理想的生化檢驗前處理方法。

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