Pokemon對乳腺癌MCF-7細胞侵襲遷移能力的影響

祖旭宇，譚 莉，周 茜，王藝蓁(南華大學附屬第一醫院臨床醫學研究所，湖南 衡陽 421001)

在我國北京、上海和廣州等大城市的統計顯示乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢[1]。乳腺癌可通過血運和淋巴等方式發生侵襲轉移，侵害肺、骨和肝等器官，是乳腺癌患者治療失敗和死亡的的主要原因。乳腺癌的轉移是一個較為復雜、由多基因參與的過程,目前乳腺癌轉移機制尚不完全清楚。Pokemon，即POK紅髓生成因子(也稱為FBI-1或Zbtb7A)，由Zbtb7基因編碼，是BTB-ZF家族成員之一，作為轉錄因子Pokemon參與細胞分化和機體發育等多種重要生命活動，有研究顯示Pokemon在肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和鼻咽癌等多種腫瘤中呈現出高表達，表明它可能在多種腫瘤的發生發展中發揮重要作用[2-5]。崔明等[6]利用免疫組織化學方法發現乳腺癌組織中pokemon蛋白細胞核表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織及乳腺增生組織，乳腺癌組織有腋窩淋巴結轉移組pokemon蛋白細胞核表達率顯著高于無腋窩淋巴結轉移組，表明pokemon基因在乳腺癌發生、發展中發揮重要作用。本文通過構建穩定表達pokemon慢病毒載體，建立穩定表達pokemon的MCF-7細胞系，觀察pokemon對乳腺癌細胞系MCF-7細胞侵襲轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

MCF-7細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞庫。細胞由DMEM培養(Hyclone,UT)維持，培養基中均含10%小牛血清( 四季青) 、2 mmol/L glutamine 和100 U青霉素(碧云天)，細胞置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養箱培養。

1.2 Pokemon過表達質粒載體構建及慢病毒的包裝

Pokemon過表達質粒載體構建及Pokemon過表達慢病毒在293T細胞內的包裝和病毒滴度的測定參照祖旭宇等[7]研究進行。

1.3 病毒轉染及穩定細胞系建立

取對數期MCF-7細胞按1×105個/孔種于6孔板中，每孔加2 mL培養基，鋪板時細胞融合度為50%左右，并培養24 h。感染實驗分為兩組，即感染含有GFP慢病毒載體和含有FPG-pokemon融合基因慢病毒載體，每組占三個孔。當細胞密度達60%時，每孔中加入1×108TU/mL滴度的病毒50 μL(MOI：50)，置于37 ℃，5%CO2中培養。12 h后更換普通培養基，轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光。觀察到綠色熒光后，利用新霉素篩選穩定表達pokemon慢病毒載體的MCF-7細胞，建立穩定性普通表達及高表達pokemon的MCF-7乳腺癌細胞系。

1.4 Western blot分析

為檢測病毒感染MCF-7細胞中Pokemon-GFP融合蛋白的表達情況，對經篩選獲得的MCF-7乳腺癌細胞系進行免疫印跡分析。 將GFP慢病毒載體和含有FPG-pokemon融合基因慢病毒載體感染MCF-7細胞于裂解液(10 mol/L HEPES,10 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0,0.1% NP-40,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF和0.5 mmol/L Na3VO4)中置冰上30 min制備細胞抽提物。30 μg可溶性蛋白于12% SDS-PAGE 膠分離,然后蛋白在260 mA下經2 h轉移至纖維膜。膜由5%牛奶在室溫下封閉45 min后,孵育GFP 一抗(1∶500)(Abcam)1 h,而后孵育羊抗兔IgG(1∶2 000) (Abcam)1 h?？贵w結合由化學熒光系統( Pierce,IL)檢測。

1.5 Transwell檢測

首先用700 μL含有15%FBS的DMEM培養基種于Transwell小室下室中，然后將200 μL含3×105個MCF-7細胞懸液種于Transwell小室上室，37 ℃ 5% CO2培養箱培養24 h后。取出小室用棉簽將膜上層細胞拭去，4%多聚甲醛固定5 min，0.5%結晶紫染色，顯微鏡下計數染色細胞。

1.6 劃痕實驗

將穩定轉染空白病毒組及pokemon表達慢病毒組的MCF-7細胞接種于6孔板中，使用含有10% FBS的DMEM培養48 h至融合度90%以上時，用200 μL移液器吸頭于細胞表面畫直線，PBS洗兩次，加入無血清培養基，分別于0、8、32 h觀察細胞遷移狀態。

2 結 果

2.1 穩定性表達Pokemon MCF-7細胞系建立

將空病毒載體和pokemon表達病毒載體感染MCF-7細胞后經新霉素篩選獲得耐藥性細胞克隆。在熒光顯微鏡下觀察穩定性細胞克隆中GFP及融合蛋白的表達情況，發現對照細胞系中綠色熒光主要集中在胞質，而穩定性表達pokemon -GFP融合蛋白表達主要分布于胞核，這與pokemon作為轉錄因子主要分布于細胞核一致(圖1)。為進一步證實在穩定細胞系中pokemon-GFP融合蛋白的表達情況，分別提取兩組穩轉細胞系總蛋白，Western blot顯示空病毒穩轉組僅有GFP蛋白表達，而pokemon表達慢病毒轉染組中6號克隆具有pokemon-GFP融合蛋白表達，說明穩定表達細胞系構建成功(圖2)。

圖1 空病毒載體及pokemon表達慢病毒載體(pokemon)感染MCF-7細胞(×40)

圖2 MCF-7細胞克隆中GFP和GFP-pokemon融合蛋白表達

2.2 pokemon對MCF-7細胞侵襲能力的影響

將3×105個MCF-7細胞懸液種于Transwell小室上室，37 ℃ 5% CO2培養箱培養24 h后，將膜上細胞擦掉，膜下層的細胞數量反應了細胞的轉移能力。經過染色后，表達pokemon-GFP融合蛋白組比對照組(NC組)到達膜下面的細胞數量明顯減少(P<0.05，圖3)。

圖3 pokemon對MCF-7細胞侵襲能力影響

2.5 pokemon對MCF-7細胞遷移能力的影響

通過劃痕實驗進一步檢測pokemon對MCF-7細胞遷移能力的影響，其結果顯示，對照組和pokemon-GFP融合蛋白組細胞遷移的距離于8 h、32 h后無明顯變化(圖4)。

圖4 pokemon對MCF-7細胞遷移能力的影響

3 討 論

乳腺癌轉移是一個受多種因素影響，機制復雜的過程，具體機制尚不清楚，也是乳腺癌防治研究的熱點。轉移相關基因是一類功能上能夠促進或阻斷腫瘤轉移潛能的基因，是腫瘤轉移發生的內在分子基礎[8]。因此揭示相關基因在乳腺癌侵襲轉移中的作用及機制是乳腺癌防治研究的重要課題。Maeda T等[9]揭示Pokemon可能是一種原癌基因，在腫瘤的形成過程中發揮至關重要的作用。Pokemon位于多種重要原癌基因的上游，調控多種原癌基因的轉錄過程，它的靶基因包括ARF、ADH5/FDH、BIRC5(survivin)、腫瘤抑制因子Rb、原癌基因C-fos 和C-myc等。這些靶基因都主要與細胞周期、細胞分化和生物合成有關，說明pokemon基因在細胞生長、分化、轉移和癌變中的重要作用[10-11]。已有研究顯示和正常乳腺組織相比，乳腺癌細胞中的pokemon存在過度表達，且乳腺癌中pokemon高表達和腋窩淋巴結轉移有關[12-13]。

慢病毒載體是由慢病毒改造而來的載體系統，其具有高效而穩定的轉染率，因此成為近年來穩定轉染較常用的載體[14-15]。由于該病毒載體具有GFP和Puromycin抗性篩選標記，FIV/Pokemon重組病毒可進一步用于動物和細胞模型的建立。MCF-7細胞系是一種經典的乳腺癌細胞系，其具有分化的乳腺癌上皮細胞一些特性，如雌二醇合成以及表達雌激素和孕激素受體[16]，是一種重要的乳腺癌研究細胞模型。本文分別用空白載體及pokemon慢病毒載體感染MCF-7細胞，通過Western blot方法檢測并證實了穩定性MCF-7細胞克隆中pokemon-GFP融合蛋白的表達。

本研究通過成功構建pokemon表達慢病毒載體，建立了穩定表達pokemon-GFP MCF-7細胞系，并且通過實驗發現pokemon可抑制MCF-7細胞侵襲能力，但對MCF-7細胞遷移能力無顯著影響。Pokemon在細胞水平可抑制MCF-7細胞侵襲能力，這一現象與在乳腺癌組織中觀察到pokemon高表達和腋窩淋巴結轉移存在正相關不一致。而Maeda T等[9]的研究也發現，雖然pokemon可誘發腫瘤的形成，但臨床研究卻證實pokemon在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的陽性率與患者的生存期呈正相關。最近Wang GC 等[17]的研究證實pokemon可通過Sox9通路抑制前列腺癌的發生發展，這說明pokemon對腫瘤發生的作用可因不同腫瘤基因背景的差異而發生改變。Pokemon在細胞水平的功能和其與臨床預后的相關性存在不一致，這也進一步提示Pokemon在腫瘤發生發展中的作用存在復雜性機制。本文在研究蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT2)在乳腺癌發生中的作用時也觀察到類似現象：PRMT2可抑制乳腺癌細胞增殖，但其在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織[18]。由于細胞較組織器官環境相對單一，基因在細胞與組織器官中可能會表現出不同功能，而對基因在細胞和組織器官中可能存在功能差異機制的闡明，將有助于人們深入了解基因在腫瘤發生發展中的復雜性作用。

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