Bcl-2與Ki-67蛋白在喉鱗癌中的表達檢測及臨床相關性分析

謝金龍，羅招陽，袁恩健，陳永春，左建宏(.解放軍第一六九中心醫院 腫瘤科，湖南 衡陽 400；.南華大學醫學院腫瘤研究所)

喉鱗癌是頭頸部最常見的鱗狀細胞癌[1]，是僅次于肺癌的第二大呼吸道惡性腫瘤，是全球第六位最常見的惡性腫瘤，每年新發病例數超過50萬，近30年來死亡率仍較高[2]，嚴重威脅著人類的健康和生命，因此對喉鱗癌進行深入研究具有十分重要的意義。

惡性腫瘤發生的過程是基因的多階段的損傷積累的結果，Bcl-2是原癌基因，其腫瘤組織中常表達異常[3]。Bcl-2高表達可抑制腫瘤細胞的凋亡，有利于變異基因的積累，增加了腫瘤細胞的侵襲轉移的機會。無限增殖是癌細胞的重要特征之一，而Ki-67是細胞增殖的重要指標[4]，能反映惡性腫瘤增殖率，其高表達是細胞增殖活躍的重要標記。而抗凋亡家族的Bcl-2蛋白和核增殖Ki-67蛋白在喉鱗癌中的表達及二者表達相關性的研究鮮見報道。因此，本研究的目的主要是檢測喉鱗癌組織和正常喉粘膜組織的中Bcl-2和Ki-67蛋白的表達，分析其與喉鱗癌的臨床病理特征之間的關系，并探討兩者之間的相關性，為喉鱗癌患者的早期診斷、轉移監測和預后評價提供實驗依據，同時也為喉鱗癌的靶向治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月～2013年12月術前未經放療、化療的喉鱗狀細胞癌手術切除存檔的病理標本54例，男44例，女10例，年齡37～76歲，平均年齡62.4歲，大于60歲有29例，小于60歲有25例。所有標本均經病理診斷和免疫組化證實為喉鱗狀細胞癌。手術病理證實18例患者伴有淋巴結轉移，36例患者無淋巴結轉移。惡性腫瘤按照2008年WHO喉鱗癌分類標準進行組織學分級：高分化(G1)16例、中分化(G2)19例、低分化(G3)19例，按照2002年國際抗癌協會(UICC)制定的TNM分期標準(第7版《病理學》教材，人民衛生出版社)，Ⅰ～Ⅱ期為37例，Ⅲ～Ⅳ期為17例。正常的喉粘膜組織(法醫尸檢)或喉癌旁正常組織42例，作為對照。

1.2 試劑

鼠抗人Bcl-2、Ki-67蛋白單克隆抗體，免疫組化即用型SP試劑盒，液體DAB酶底物顯色試劑盒，上述試劑均購自福建邁新生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

高壓鍋，LEICA RM125輪式切片機，Olympus BX41顯微鏡，丹吉爾圖像采集系統。

1.4 實驗方法

SP免疫組織化學染色按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學分析

結果判定參照Pavlovic B[5]等的標準。應用計算機spss13.0統計軟件包進行相關數據統計分析。計數資料用率表示，等級資料采用非參數的秩和檢驗，組間比較用χ2檢驗，Bcl-2和Ki-67在喉鱗癌組織中的表達的相關性比較采用Spearrnan相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Bcl-2和Ki-67蛋白在正常的喉粘膜組織和喉鱗癌組織中的表達檢測

Bcl-2和Ki-67蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達情況(見圖1)：Bcl-2蛋白著色主要定位于細胞的胞質和胞膜中，在喉鱗狀細胞癌中陽性率為70.37%；而在正常喉粘膜組織中不表達或在基底層微弱表達，陽性率僅為9.52%(表1)，Bcl-2蛋白在喉鱗癌中的表達水平明顯高于在正常喉粘膜鱗狀上皮組織中的表達水平(P<0.05)。而Ki-67蛋白的著色位于細胞核內，呈棕色顆粒，在喉鱗癌組織中陽性率為81.48%，在正常喉粘膜組織陽性表達率為16.7%，亦在喉鱗癌組織中陽性率顯著高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 喉鱗癌組織中及正常喉粘膜鱗狀上皮組織中Bcl-2和Ki-67蛋白的表達分析

2.2 Bcl-2和Ki-67蛋白的表達與其臨床病理關系分析

Bcl-2蛋白的表達水平與臨床分期、淋巴結轉移有明顯相關性(P<0.05)，但與性別、年齡等無關。Ki-67蛋白在喉鱗癌組織TNM分期中陽性表達晚期高于早期、且與分化程度明顯相關，在分化程度較低的喉鱗癌癌組織中表達較高；與淋巴結轉移有關(P<0.05)，與年齡和性別無關(P>0.05，見表2)。

圖1 IHC分析Bcl-2、Ki-67在正常組織和喉癌組織中的表達(×400)

表2 喉鱗癌組織Bcl-2和Ki-67蛋白表達與臨床資料的相關性分析

2.3 Bcl-2蛋白和Ki-67蛋白表達相關性

44例Ki-67蛋白陽性表達的喉鱗癌組織標本中有34例同時表達Bcl-2蛋白。相關性分析結果顯示，Bcl-2蛋白與Ki-67表達呈中度正相關(rs=0.317，P<0.05)。

表3 Bcl-2蛋白和Ki-67蛋白在LSCC中表達的相關性分析

3 討 論

喉鱗癌是頭頸部最常見的上皮組織來源的惡性腫瘤之一，該病具有起病隱匿、侵襲力強、易復發和轉移以及預后差的特點[6]，因此，深入研究其分子機制具有十分重要意義。

正常細胞的增殖、分化和凋亡處于一種動態平衡狀態，而增殖和凋亡的失衡[7]是導致惡性腫瘤發生的重要機制之一。Bcl-2是屬于一類重要的抗凋亡基因，其表達失調將引起細胞紊亂、參與腫瘤的發生[8]，同時，本課題組前期研究發現Bcl-2高表達還能促進腫瘤細胞的侵襲與轉移[9]。在本實驗中，喉鱗癌中的Bcl-2呈現高表達，表達陽性率明顯高于正常組織，且與喉鱗癌的淋巴結轉移密切相關(P<0.01)，提示Bcl-2蛋白可能參與了喉鱗癌發生與發展，這為臨床診斷喉鱗癌提供了參考價值[10]。Ming Geng等研究發現Bcl-2表達水平高的胃癌患者容易出現廣泛淋巴結轉移，其預后較差[11]，與本研究結果一致。本研究結果顯示：Bcl-2蛋白在喉鱗癌Ⅲ～Ⅳ期中的表達顯著高于喉鱗癌Ⅰ～Ⅱ期中的表達(P<0.05)，腫瘤臨床分期愈晚，組織分化惡性程度愈高，Bcl-2蛋白陽性表達也愈高。在甲狀腺癌[12]、肺癌[13]、膽囊癌[14]、前列腺癌[15]和頭頸部鱗癌[9]中Bcl-2蛋白的高表達與惡性腫瘤的侵襲轉移和預后不良密切相關，上述報道與本課題研究也保持一致。同時，Bcl-2高表達的惡性腫瘤細胞也可能因為逃避凋亡而過度積累，對凋亡信號變得不敏感，則使腫瘤細胞獲得生存優勢，從而有利于喉鱗癌的發生及發展[9]。總之，Bcl-2高表達在喉鱗癌的惡性進展、局部浸潤轉移及頸淋巴結轉移中起重要的作用，是其預后不良的一個標志。

Ki-67蛋白是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是可靠并迅速地反映惡性腫瘤增殖率的指標，其高表達是細胞增殖活躍的重要標記物[16]，對腫瘤的轉移及預后有影響[17]。本課題組研究發現：Ki-67蛋白在喉鱗癌中的陽性率為81.48%，而在正常喉粘膜中的表達僅為16.67%，兩者比較有顯著的意義(P<0.05)。Ki-67的表達還與分期和頸淋巴結轉移有關，有頸淋巴結轉移的喉鱗狀細胞癌組織中Ki-67蛋白的表達高于未發生轉移者(P< 0.05)，提示喉鱗癌細胞增殖活躍與侵襲性強，易發生轉移，預后不良等密切相關。本研究結果與Rademakers SE等[18]所報道的Ki-67蛋白在喉鱗癌中的高表達增加了侵襲轉移風險的結論相一致。

本研究結果顯示：喉鱗癌中Bcl-2和Ki-67蛋白陽性表達率與組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移密切相關，但與年齡、性別等無顯著相關性(P>0.05)。與正常組織比較，在喉鱗癌中Bcl-2蛋白與Ki-67蛋白表達明顯上調，且兩者呈顯著相關(rs=0.317,P<0.05)。這與Rahman F等用DigiproTM4.0版圖像分析軟件在口腔鱗狀上皮研究中Bcl-2高表達，Ki-67蛋白指數較高，兩者對比有顯著的統計學意義[19]的報道相符合。也有學者[20]認為，可以把喉鱗癌中Bcl-2和Ki-67蛋白的表達作為喉鱗癌放射治療預后判定的指標之一，隨表達的增強喉鱗癌對放療敏感性相應降低，對于兩者表達陰性的患者放療效果顯著。但是，有關研究Bcl-2與Ki-67在喉鱗癌發展中協同作用的分子機制尚未完全闡明，有待深入的研究。

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