S100A11慢病毒表達載體的構建及其在肝癌細胞中的表達

劉德勇，張慶麗，龍曉蘭，彭和人，謝海龍(.湖南環境職業技術學院病理教研室，湖南 衡陽 4005； .南華大學腫瘤研究所)

我國是原發性肝癌的高發區，死亡率居惡性腫瘤第二位，復發轉移是肝癌死亡的主要原因[1]。目前肝癌的主要治療方法是分子靶向治療、化療栓塞治療、肝癌規范化治療等[2-3]。S100鈣結合蛋白A11(S100A11)是S100家族的重要成員之一[4]。研究發現S100A11與腫瘤的發生和轉移密切相關，在結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達，尤其是在肝癌中，S100A11高表達能促進肝癌的侵襲和遷移[5-8]。因此，S100A11可作為肝癌潛在的治療靶點。本研究通過慢病毒感染建立Huh-7 S100A11穩定細胞珠，為肝癌的侵襲和遷移機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

293T細胞購自中國科學院上海生化細胞所；Huh-7細胞購自ATCC細胞庫；Huh-7EGFRvIII細胞由本實驗室構建保存。3種細胞均用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃ 5%CO2的條件下培養。

1.2 材料和試劑

限制性內切酶、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、Real-Time PCR試劑盒購自TaKaRa公司；dNTP購自Sangon公司；胎牛血清、DMSO、DMEM均購自Gibco公司；6孔板、凍存管、細胞培養皿購自Corning公司。T-PER 組織蛋白裂解液、BCA 蛋白分析試劑盒和Lumi-phosWB發光底物均購自Pierce公司；DNA提純試劑盒購自Axygen公司；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體由上海康城公司生產；S100A11抗體購自abcom公司；慢病毒包裝質粒pWPT、pAX2、pMD2.G由日內瓦大學T.Didier博士饋贈。所用引物均在上海Invitrogen公司合成。

1.3 慢病毒表達載體質粒構建及鑒定

提取細胞總RNA:Huh-7EGFRvIII細胞于6cm培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中常規培養。待細胞生長至90%左右，PBS洗細胞2次，加入1 mL Trizol，充分吹打后移至1.5 mL EP管中；加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15s，在室溫下孵育5 min，12 000 g離心15 min；將上清移至新的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，在-20℃條件下孵育20 min，4℃，12,000 g 離心10 min；去上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃，7500 g 離心5 min；室溫干燥20 min，用DEPC水處理后的H2O溶解，分光光度計定量RNA。

逆轉錄：提取的細胞總RNA 取1 μL與Oligo dT (10 μmol/L) 1 μL 混合，72 ℃孵育5 min，然后置于冰上5 min；之后加入15 μL反轉錄混合液(6.1 μL NucLease-free H2O，4 μL 5×RT Buffer，1 μL 10 mmol/L dNTPs，2 2.4 μL 25 mmol/L MgCL，1 μL Improm-ⅡTM Reverse Transcriptase，0.5 μL Rnase RibonucLease Inhibitor)，分別于25 ℃孵育5 min，42 ℃孵育1 h，70 ℃孵育15 min，獲得cDNA。

PCR:GenBank查找 S100A11基因序列，設計并合成引物：S100A11-F：5′CGacgcgtgccgc CATGGCAAA AATCTC CAGCC3′；S100A11-R：5′ATAAGAATgcggccgcTCAGGTCCGCTTCTGGG A AG3′。擴增產物為含有S100A11基因完整的序列，長度為348 bp。以cDNA 為模板，反應體系：1 μL 模板，5 μL 10×buffer，5 μL 2 mM/L dNTP，2 μL MgSO4，1 μL KOD-plus酶，引物各1 μL，以 ddH2O 補足50 μL。PCR反應條件：變性94 ℃ 4 min ； 94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，68 ℃ 4 min，30個循環；68 ℃ 10 min； 10 ℃保存，1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

載體構建：回收PCR產物與pWPT 載體，同時用MluⅠ和NotⅠ酶進行酶切。酶切產物經回收后，用連T4 DNA接酶連接，連接產物轉化Top10感受態菌。陽性細菌克隆，命名為pWPT-S100A11，送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.4 慢病毒載體包裝

取6代293T細胞復蘇于6 cm培養皿，長滿后接種到 10 cm培養皿，常規培養至細胞密度為70%。包裝當天早上將培養基換成無血清DMEM，37 ℃孵育2 h。目的基因質粒pWPT-S100A11、pWPT-GFP為對照各20 μg，包裝質粒 PAX2 質粒 10 μg，外殼質粒 pMD2.G質粒6 μg，加水補足至 500 μL，逐滴加入2.5 mol/L CaCl250 μL，輕輕混勻，再逐滴加入 500 μL 2× HBS (280 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L Na2HPO4，12 mmol/L Glucose，50 mmol/L HEPES，pH 7.05)，每滴加入后均需充分混勻，然后室溫放置 5～20 min。再滴加入 293T 細胞10 cm培養皿中，滴入部分的培養基顏色變淺，滴加完畢后輕柔搖晃混勻。 6～8 h后，將培養基更換為新鮮的DMEM+10%FBS，此時顯微鏡下可以觀察到培養皿底部未長細胞的部分有沙狀鈣顆粒。 37 ℃培養48 h，熒光顯微鏡觀察pWPT-GFP組感染效率，收集293T細胞培養上清至5 mL離心管中，2 000 rpm離心5 min，用10 mL針筒吸取上清，然后將針頭換成0.22 μm濾器，過濾后分裝于EPP管中，即為包裝得到的慢病毒顆粒懸液，該病毒可直接用于感染或-80 ℃保存。

1.5 慢病毒感染Huh-7細胞

將生長良好的Huh-7細胞鋪于6 孔板中，種植數目不宜過多，細胞生長至50%時開始感染。更換培養基，以4 μg/mL的終濃度加入Polybrene，37 ℃富裕30 min后分別加入pWPT-GFP與pWPT-S100A11慢病毒懸液100 μL，繼續培養8 h，更換培養基。待細胞生長至90%后傳代。48小時后GFP病毒感染的細胞可見熒光，以此初步判斷病毒包裝及感染是否成功。

1.6 Real-Time PCR檢測感染細胞S100A11 mRNA的表達

Huh-7細胞、經上述步驟感染的Huh-7GFP細胞和Huh-7-S100A11細胞培養于6 cm皿中，生長至90%后收集。按照上述方法提取細胞總RNA，并進行逆轉錄得產物cDNA，將cDNA進行定量。以cDNA為模板進行TR-PCR。引物：S100A11上游引物GAGTCCCTGATTGCTGTCTTCC，S100A11下游引物AGGGTCCTTCTGGTTCTTTGTG。反應體系：1 μL 模板，5 μL 10×buffer，5 μL 2 mmol/L dNTP，2 μL MgSO4，1 μL KOD-pLus酶，引物各1 μL，以ddH2O補足50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 4 min ； 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，30個循環；68 ℃ 10 min； 4 ℃保存。PCR產物用 1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。儀器采用ABI PRISM 7900HT。采用比較CT(Cycle threshold)法相對定量。

1.7 Western blotting 檢測感染細胞S100A11蛋白的表達

取Huh-7細胞、Huh-7GFP細胞、Huh-7-S100A11細胞種植于6 cm皿中，37 ℃培養生長至90%后，用預冷的PBS緩沖液洗3遍，加入100 μL預冷的蛋白裂解液，收集細胞至1.5 mL EP管中，放在冰上裂解30 min后，12 000 g 4 ℃離心15 min，取上清用BCA試劑盒測定濃度。剩余上清移至另外EP管中并加入SDS loading buffer混勻后，煮沸10 min，置-20 ℃保存。三種蛋白各取20 μg樣品蛋白經12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，取PVDF膜與電泳后的凝膠于轉膜儀上進行轉移40 min。轉膜結束后用PBS于振蕩器上洗膜10 min，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉配置的封閉液中，封閉2 h。S100A11抗體1∶100稀釋，GAPDH抗體1∶5 000稀釋后加一抗，4 ℃孵育過夜。次日用PBST洗3次，每次15 min。用HRP標記的羊抗鼠抗體1∶1 000稀釋后，孵育2 h。用PBS洗3次，每次10 min后，加顯影劑顯影。

2 結 果

2.1 慢病毒表達載體質粒構建及鑒定

PCR擴增得到S100A11基因片段，長度為348 bp(圖1A)。將S100A11基因片段經MluⅠ和NotⅠ酶切后，克隆入pWPT載體，酶切鑒定(圖1B)，陽性克隆送Invitrogen公司測序。測序結果經對比與GenBank中標準一致(圖1C)。

圖1 慢病毒表達載體構建

2.2 慢病毒載體包裝

pWPT-S100A11、pWPT-GFP慢病毒表達載體包裝于293T細胞，37 ℃培養48 h后，熒光顯微鏡觀察可見綠色熒光(圖2)，說明病毒包裝成功。

圖2 包裝48 h后熒光圖(×100)

2.3 慢病毒感染Huh-7細胞

pWPT-S100A11與pWPT-GFP慢病毒感染Huh-7細胞培養48 h后GFP病毒感染的細胞可見熒光，由此可以判斷病毒感染成功。

圖3 pWPT-GFP慢病毒感染Huh-7細胞熒光圖(×400)

2.4 Real-Time PCR檢測感染細胞S100A11 mRNA的表達

pWPT-S100A11與pWPT-GFP慢病毒感染Huh-7細胞后，通過Real-Time PCR檢測Huh-7、Huh-7GFP、Huh7-S100A11三總細胞中S100A11mRNA的表達情況，結果顯示Huh7-S100A11中S100A11mRNA表達量最高，Huh7-S100A11細胞中S100A11的表達量明顯高于其它兩組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.5 Western blotting 檢測感染細胞S100A11蛋白的表達

通過Western blotting檢測Huh7、Huh7-GFP、Huh7-S100A11三種細胞中S100A11蛋白的表達，結果顯示Huh7-S100A11中S100A11的表達量明顯高于其他兩種細胞(圖4)。

圖4 不同細胞中S100A11蛋白的表達

3 討 論

目前研究認為，S100A11參與多種生物學過程的調節，例如，調節酶的活性、細胞的生長和凋亡、炎癥反應等[9]。編碼S100A11的基因位于1號染色體q21區，該區易發生重排，引起腫瘤的發生和轉移。S100A11對腫瘤細胞具有雙向調節的作用，在食管癌、膀胱癌中低表達，在大腸癌、胰腺癌、淋巴瘤中高表達。S100A11在肺鱗癌和肺腺癌中高表達，在小細胞肺癌中低表達。S100A11也可以作為腫瘤抑制因子，抑制P21的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長增值[10]。S100A11在對腫瘤細胞具有雙向調節作用，在腫瘤的診斷和防治上具有一定的意義。研究發現S100A11的表達升高，可以促進肝癌細胞的侵襲遷移。

慢病毒載體(lentiviral vectors,LV) 包含了包裝、感染、穩定整合所需要的遺傳信息，是新發展起來的基因載體。利用表達載體和包裝質粒同時共感染細胞可以產生高滴度的病毒顆粒，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染。目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，慢病毒載體可以將攜帶的目的基因整合到宿主的基因組中，從而高水平的表達效應分子[11]。慢病毒載體可感染分裂細胞和非分裂細胞、 轉移基因片段容量較大、 目的基因表達時間長、 不易誘發宿主免疫反應等優點[12]。

本研究采用基重組技術，構建重組慢病毒載體pWPT-S100A11，感染Huh7-細胞，獲得穩定Huh7 S100A11細胞，并鑒定S100A11表達量升高，為進一步研究S100A11基因在肝癌侵襲遷移中的作用機制奠定了一定的實驗室基礎。

[1]Shin JW,Chung YH.Molecular targeted therapy for hepatocellular carcinoma:current and future[J].World J Gastroenterol,2013,19(37):6144-6155.

[2]Kim HY,Park JW.Clinical trials of combined molecular targeted therapy and locoregional therapy inHepatocellular carcinoma:past,present,and future[J].Liver Cancer,2014,3(1):9-17.

[3]Bruix J,Gores GJ,Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma:clinical frontiers and perspectives[J].Gut,2014,63(5):844-855.

[4]Sakaguchi M,Huh NH.S100A11,a dual growth regulator of epidermal keratinocytes[J].Amino Acids,2011,41(4):797-807.

[5]Melle C,Ernst G,Schimmel B,et al.Different expression of calgizzarin (S100A11) in normal colonic epithelium,adenoma and colorectal carcinoma[J].Int J Oncol,2006,28(1):195-200.

[6]Ohuchida K,Mizumoto K,Ohhashi S,et al.S100A11,a putative tumor suppressor gene,is overexpressed in pancreatic carcinogenesis[J].Clin Cancer Res,2006,12(18):5417-5422.

[7]Xiao MB,Jiang F,Ni WK,et al.High expression of S100A11 in pancreatic adenocarcinoma is an unfavorable prognostic marker[J].Med Oncol,2012,29(3):1886-1891.

[8]Luo X,Xie H,Long X,et al.EGFRvIII mediates hepatocellular carcinoma cell invasion by promoting S100 calcium binding protein A11 expression[J].PLoS One,2013,20,8(12):1-9

[9]Gross SR,Sin CG,Barraclough R,et al.Joining S100 proteins and migration:for better or for worse,in sickness and in health[J].Cell Mol Life Sci,2014,71(9):1551-1579.

[10]Salama I,Malone PS,Mihaimeed F,et al.A review of the S100 proteins in cancer[J].Eur J Surg Oncol,2008,34(4):357-364.

[11]方芳,朱平.慢病毒載體的改進為基因治療帶來了新的希望[J].中國實驗血液學雜志,2013,21(5):1336-1339.

[12]Segura MM,Mangion M,Gaillet B,et al.New developments in lentiviral vector design,production and purification[J].Expert Opin Biol Ther,2013,13(7):987-1011.