阿納其根脂肪酸成分分析及其對蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B 抑制作用研究

古麗娜爾·卡斯木，馬慶苓，古麗米熱·卡哈爾，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1 新疆醫科大學研究生學院，烏魯木齊 830054;2 中國科學院新疆理化技術研究所干旱區植物資源化學重點實驗室;3新疆特有藥用資源利用省部共建國家重點實驗室培育基地，烏魯木齊 830011

維藥阿納其根［Anacyclus pyrethrum (L)DC］為菊科植物除蟲菊的干燥根，具有清除異常粘液質，開滯止痛的功效，其性味為三級末四級首干熱［1-3］。在維吾爾醫中，阿納其根常被用來治療白癜風［4］，但是其活性成分及其作用機理還不清楚;另據《維吾爾藥志》［5］記載，阿納其根中含有黃酮、墻草堿、菊糖，揮發油、鞣質及氨基酸。其脂肪酸化學成分及其生物活性的研究未見深入報道。GC-MS 聯用作為一種新技術，具有準確、方便快捷的特點，在進行油脂和揮發性成分的測定中得到廣泛的應用，成為一種國際通用的油脂脂肪酸測定方法［6］。為了進一步開發利用阿納其根食用和藥用價值，本論文利用索氏提取法從阿納其根中提取油脂，經甲酯化處理后，用氣相色譜質譜法(GC/MS)對脂肪酸組成進行了分析和鑒定;同時對其進行蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制作用研究，以期為阿納其根的深入研究提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

阿納其根:購于巴基斯坦，由經新疆維吾爾自治區維吾爾醫院藥劑科主任鑒定為菊科植物除蟲菊［Anacyclus pyrethrum(L)DC］的干燥根;其余試劑均為分析純。

GC-MS Agilent 7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司);BP211D 型電子天平(德國Sartorius 有限公司);HH-W600 三用恒溫水箱(江蘇省金壇市醫療儀器廠);SpectraMax M5 型酶標儀;平底96 孔ELISA 板。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

稱取30 g 阿納其根3 份，分別加入正己烷、乙醚、氯仿各80 mL，索氏提取法提取5 h，減壓回收溶劑，得淡黃色油狀液體。

稱取油樣0.1 g，置50 mL 錐形瓶中，加0.5 mol/L 氫氯化鉀甲醇溶液2 mL，在65 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加庚烷4 mL，繼續在65 ℃水浴中加熱回流5 min 后，放冷，加飽和氯化鈉溶液10 mL 洗滌，搖勻，靜置使分層，取上層液，用水洗滌3 次，每次2 mL，上層液經無水硫酸鈉干燥，合并上清液于小瓶中待測。

1.2.2 GC-MS 分析

色譜條件:HP-5MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:起始溫度為150 ℃，以2 ℃/min 的速率程序升溫至220 ℃，保持5 min，以10℃/min 升溫至250 ℃。進樣口溫度:260 ℃;載氣:99.999% He;流速:1.0 mL/min;壓力96.1 kPa;進樣量1 μL;分流比20∶1。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度:230 ℃，質量掃描范圍:30～350 amu。分流比:150∶1。

取1.2.1 項下制備所得上清液0.1 μL 進行測定，按峰面積歸一化法計算化學成分的質量分數。所得質譜圖采用Nist147 譜庫及Wiley7 譜庫進行檢索。

1.2.3 PTP1B 抑制作用研究

按照文獻［7］方法，即三種不同溶劑(正己烷、乙醚、氯仿)提取的樣品用適量DMSO 溶解，反應體系中緩沖液(pH 7.0，1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L HEPES)，0.09 μmol/L his-PTP1B1-3211 μL，35 mmol/L pNPP，總體積為200 μL。室溫孵育10 min，再加入pNPP 20 μL，室溫孵育30 min 后，用3 mol/L NaOH 10 μL 終止反應。在405 nm 處測定吸收值，以不含酶溶液體系為空白對照。

IC50值的確定:按上述活性測定方法，提取物用DMSO 溶解，按不同劑量加入，405 nm 處測定吸收值，每個實驗重復3 次。按抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%，計算不同濃度的抑制率。應用Origin 軟件計算IC50值。以此判斷阿納其根脂肪酸對PTP1B 的抑制能力。

2 結果與討論

2.1 阿納其根油脂肪酸成分分析

按照1.2.2 項所述條件，測得阿納其根用正己烷提取油脂脂肪酸甲酯的GC-MS 總離子流色譜圖(TIC)，脂肪酸甲酯成分有8 種;用乙醚提取油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜-質譜總離子流色譜圖(TIC)，脂肪酸甲酯成分有12 種;脂肪酸甲酯成分有8 種;用氯仿提取油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜-質譜總離子流色譜圖(TIC)，脂肪酸甲酯成分有5 種;見圖1～圖3，見表1～表3。

圖1 阿納其根正己烷提取油脂脂肪酸甲酯GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram (TIC)of fatty acid component of A.pyrethrum extracted by n-hexane

表1 阿納其根正己烷提取油脂脂肪酸甲酯成分和含量Table 1 Main components of fatty acids of A.pyrethrum extracted by n-hexane

圖2 阿納其根乙醚提取油脂脂肪酸甲酯GC-MS 總離子流圖Fig.2 GC-MS TIC of fatty acid component of A.pyrethrum extracted by diethyl ether

圖3 阿納其根氯仿提取油脂脂肪酸甲酯GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS TIC of fatty acid component of A.pyrethrum extracted by chloroform

表2 阿納其根乙醚提取油脂脂肪酸甲酯成分和含量Table 2 Main components of fatty acids of A.pyrethrum extracted by diethyl ether

由表1～表3 可知，阿納其根脂肪酸中主要成分有亞油酸為、棕櫚酸、油酸，亞麻酸等。其中亞油酸和棕擱酸不飽和脂肪酸的含量較高，可達60%以上，具有較高的營養價值。亞麻酸和亞油酸是人體必需脂肪酸，且無法由人體自行合成，必須從食物中攝取獲得［8］。抑制缺血性心血管疾病等方面起重要作用［9］。由此可見，阿納其根油是很好的保健食品，具有較高食用藥用價值。

表3 阿納其根氯仿提取油脂脂肪酸甲酯成分和含量Table 3 Main components of fatty acids of A.pyrethrum extracted by chloroform

2.2 PTP1B 抑制作用的研究

將得到的阿納其根3 種溶劑提取油脂脂肪酸進行PTP1B 抑制作用的研究。結果表明，阿納其根脂肪酸對PTP1B 有較強的抑制作用，正己烷提取脂肪酸IC50值為5.27±0.40 μg/mL;乙醚提取脂肪酸IC50值為4.71±0.08 μg/mL;氯仿提取脂肪酸IC50值為7.01±1.98 μg/mL。

3 結論

在阿納其根3 種溶劑提取油脂脂肪酸中主要成分為亞油酸、棕櫚酸、油酸、亞麻酸。而且其正己烷提取脂肪酸、乙醚提取脂肪酸、氯仿提取脂肪酸對PTP1B 抑制作用的IC50值分別為5.27±0.40、4.71±0.08、7.01±1.98 μg/mL，都對PTP1B 有較強的抑制作用。

阿納其根中亞麻酸、亞油酸和棕擱酸含量較多，具有良好的開發利用價值和廣闊的應用前景。本文為維藥阿納其根在食品及藥用產品領域的開發提供了一定理論依據，并為阿納其根的深入研究和資源利用奠定了基礎。

1 Ministry of Health Pharmacopoeia Commission(中華人民共和國衛生部藥典委員會).Republic of China Ministry of Health Drug Standards·Uygur Medicine Branch(中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊).Urumqi:Xin-jiang Science and Technology Publishing House，1999.43.

2 Xinjiang Uygur Autonomous Region Health Department Compiled(新疆維吾爾自治區衛生廳編).Uygur Medicine Standards(維吾爾藥材標準).Urumqi:Xinjiang Science and Technology Publishing House，1993.143-144.

3 Gu YS(顧永壽)，Gu YF(顧永福).Commonly Used Medicinal Herbs of Uygur Medicine(維吾爾醫常用藥材).Urumqi:Xinjiang Science and Technology Publishing House，1992.22-23.

4 Abla R(阿布拉·熱娜古麗)，Dolkun M(多力坤·買熱木).Preliminary study of vitiligo.Chin J Ethnomed Ethnopharm(中國民族醫藥雜志)，2011，9:45-46.

5 Liu YM(劉勇民).Pharmacography of Uighur(維吾爾藥志.下).Urumqi:Xinjiang Science and Technology Publishing House，1999.433-434.

6 Li GY(李高陽)，Ding XL(丁霄霖).Analysis of fatty acids of flaxseed oil with GC-MS.Food Mach(食品與機械)，2005，(21)5:30-32.

7 Hu XX(胡辛欣)，Yang YF(楊雁芳)，Zhang YT(張英濤).Preliminary exploration of inhibitory activities of Salvia species on PTP1B.Acta Pharm Sin(藥學學報)，2009，44:440-442.

8 Bi YL(畢艷蘭)，Guo Z(郭諍)，Yang TK(楊天奎).Oil Chemistry(油脂化學).Beijing:Chemical Industry Publishing House，2005.9-10.

9 Carovic-Stanko K，Orlic S，Politeo O，et al.Composition and antibacterial activities of essential oils of seven Ocimum taxa.Food Chem，2010，119:196-201.