ERCC1 表達(dá)水平與以鉑類藥物為基礎(chǔ)的胃癌新輔助化療療效相關(guān)性研究

李 濤 梁美霞 馮道夫 李 婷 陳 凜

胃癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的惡性腫瘤性疾病，高發(fā)病率和病死率是本病主要特點(diǎn)。根治性、規(guī)范化外科手術(shù)已經(jīng)達(dá)到前所未有的高度，仍無(wú)法顯著提高胃癌患者5 年生存率。術(shù)前采取新輔助化療使進(jìn)展期胃癌病變縮小、減少腫瘤及所屬淋巴結(jié)對(duì)周圍臟器的侵犯是提高胃癌治療效果的一個(gè)方向。隨著胃癌新輔助化療受到越來(lái)越多的重視，如何預(yù)測(cè)胃癌化療敏感度的問(wèn)題日漸突出。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)部分患者經(jīng)化療后仍然出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，原因在于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感［1，2］。通過(guò)藥物基因組學(xué)對(duì)患者的基因進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)對(duì)特定藥物具敏感度或抵抗性的患者人群的一些疾病相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異，預(yù)測(cè)該化療藥物的療效，選擇合適的藥物進(jìn)行化療，已成為提高療效，減少無(wú)效治療的合理選擇。隨著對(duì)腫瘤藥物耐藥性研究的深入，相繼發(fā)現(xiàn)了許多和耐藥有關(guān)的基因，如與鉑類相關(guān)的切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementation 1，ERCC1)。ERCC1 是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，參與DNA 鏈的切割和損傷修復(fù)過(guò)程。臨床研究已證實(shí)ERCC1 表達(dá)水平與多種腫瘤鉑類藥物化療的療效和生存期呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)水平低的患者對(duì)鉑類藥物敏感，反之表達(dá)水平高的患者則耐藥［3～5］。以此為理論依據(jù)，本研究擬分析進(jìn)展期胃癌患者術(shù)前應(yīng)用氟尿嘧啶類和鉑類藥物后標(biāo)本組織中ERCC1 水平變化，探討其與化療療效之間的關(guān)系，分析ERCC1 作為化療療效生物學(xué)標(biāo)志物可能性，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)胃癌患者個(gè)體化治療，必將對(duì)提高胃癌患者總體生存率具有重要意義［6］。

資料與方法

1.研究對(duì)象:入組標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)胃鏡活檢病理活檢確診為胃癌患者;②所有患者治療前均需經(jīng)過(guò)超聲胃鏡(EUS)、CT(或PET-CT)和腹腔鏡探查進(jìn)行治療前分期評(píng)估(TNM)，按照第7 版AJCC 分期為Ⅱ～Ⅲ期患者;③患者無(wú)手術(shù)相關(guān)禁忌證，預(yù)計(jì)能夠進(jìn)行根治性外科切除;④KPS ＞60;ECOG 評(píng)分:0 ～2;⑤年齡20 ～75 歲;⑥過(guò)去未曾進(jìn)行過(guò)化療;⑦根據(jù)RECIST 1.1 標(biāo)準(zhǔn)［7］要求具有可測(cè)量病灶;⑧血液檢查和身體狀況能夠耐受化療藥物。篩選前7 天內(nèi)(包括7 天)時(shí)，基線實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)要求:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(4 ～10)×109/L、血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L、血紅蛋白≥100g/L、肝功能＜3 倍正常上限值、總膽紅素≤1.5mg/dl、血清肌酐≤1.2mg/dl;⑨簽署知情同意書。

2.術(shù)前化療:入組患者均嚴(yán)格按照SOX 方案進(jìn)行。具體方案:替吉奧膠囊(S-1)80mg/m2，第1 ～14 天，口服;注射用奧沙利鉑130mg/m2第1 天，靜脈滴注，每3 周重復(fù)。如果患者血液學(xué)毒性達(dá)到3 或4 級(jí)或非血液毒性達(dá)2、3 或4 級(jí)，調(diào)整每日S -1 劑量由120mg 減為100mg，100mg 減為80mg，80mg 減為60mg，或由于毒性而停止給藥。隨后的劑量根據(jù)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。注射用奧沙利鉑劑量調(diào)整如下:由130mg/m2調(diào)整為100mg/m2或85mg/m2。安全性分析依據(jù)NCI-CTC 4.0版本進(jìn)行評(píng)估。

3.手術(shù)和病理:在患者完成最后1 次化療后至少4 周才可行手術(shù)治療。手術(shù)按照J(rèn)GCA(Japanese Gastric Cancer Association)標(biāo)準(zhǔn)［8］行D1/D2淋巴結(jié)清掃。術(shù)中標(biāo)本送檢后均由專業(yè)的病理學(xué)專家進(jìn)行檢查，本研究病理報(bào)告相關(guān)要求:①WHO 和Lauren 分類;②腫瘤浸潤(rùn)層次;③切緣是否癌殘留(R0:無(wú)殘存腫瘤/R1:鏡下可見(jiàn)殘存腫瘤/R2:肉眼可見(jiàn)殘存腫瘤);④分組淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞殘留;⑤脈管癌栓;⑥免疫組化;⑦病理學(xué)評(píng)價(jià)(按照日本標(biāo)準(zhǔn)記錄):0 級(jí)(無(wú)療效):無(wú)證據(jù)顯示有效。1 級(jí)(輕微療效):1a 級(jí)(療效極輕微):存活腫瘤細(xì)胞占腫瘤區(qū)2/3 以上。1b 級(jí)(療效輕微):存活腫瘤細(xì)胞占據(jù)腫瘤區(qū)1/3 以上，但＜2/3。2 級(jí)(療效明顯):存活腫瘤細(xì)胞占據(jù)腫瘤區(qū)＜1/3。3 級(jí)(完全緩解):無(wú)存活腫瘤細(xì)胞，建議追加切片檢查證實(shí)結(jié)果。術(shù)中留取胃癌新輔助化療患者新鮮組織標(biāo)本(正常組織與腫瘤組織)，新鮮組織標(biāo)本收集要求精確取材部位、足量，并能夠在離斷血管后30min 內(nèi)進(jìn)行，-80℃保存。

4.代謝酶活性測(cè)定:術(shù)中留取胃癌新輔助化療患者新鮮組織標(biāo)本(正常組織與腫瘤組織)，采用RT-PCR 方法對(duì)其進(jìn)行ERCC1 水平測(cè)定。(1)組織總RNA 提取:取組織樣本100mg 左右，在液氮保護(hù)下進(jìn)行研磨，待研磨完全后，加入1ml Trizol，并提取RNA(詳見(jiàn)Invitrogen 公司Trizol 說(shuō)明書，簡(jiǎn)單描述如下):①加入1ml Trizol 試劑后，室溫孵育5 ～10min;②將其轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep 管中，加入200μl 氯仿，混勻，室溫放置5min，4℃×12000r/min×15min 離心;③可見(jiàn)分為兩層，上層為水相、下層為有機(jī)相，將上層液體轉(zhuǎn)移至一新的Ep 管中，加入500μl 異丙醇，室溫放置10min，4℃×12000r/min ×10min離心;④棄上清，加入新鮮配制的75%乙醇重懸沉淀，4℃×7500r/min×5min 離心;⑤棄上清，沉淀晾干后，用DEPC 處理的無(wú)菌水溶解，至于-70℃保存;⑥紫外吸光光度法檢測(cè)RNA濃度和純度(純度1.9 ～2.1，濃度＞200μg/ml 為合格產(chǎn)品，可用于下一步實(shí)驗(yàn))。(2)cDNA 合成:采用cDNA 第1 鏈合成試劑盒合成cDNA:①按照以下體系加樣:上述提取的總RNA:2.0μg;Oligod T:4.0μl;DEPC 處理水:補(bǔ)至14.0μl，共計(jì)14.0μl 反應(yīng)體系，將其混勻后置于70℃水浴放置5min;②取出后立即放入冰中冷卻2 ～3min，簡(jiǎn)單離心，加入下列成分:5×MMLV buffer:5.0μl;M -MLV RT:1.0μl;dNTPs:5.0μl;iRNasin:0.5μl，將總計(jì)25.0μl 反應(yīng)體系混勻后，置于37℃水浴放置5min;③反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物置于-20℃保存。

5. Real - time PCR 檢測(cè):反應(yīng)條件:50℃ 2min;95℃5min;95℃5s，60℃1min，讀板;41 循環(huán)。(1)每一樣本需要檢測(cè)的指標(biāo)有兩個(gè)，分別為β -actin，ERCC1，每一指標(biāo)做3復(fù)孔。(2)記錄每一指標(biāo)的CT值，分別記為CTactin，CTERCC1。ΔCTERCC1 = CTERCC1 -CTactin。(3)每一患者有正常組織和癌組織，其ΔCT記為:ΔCTERCC1 正常和ΔCTERCC1 癌組織，ΔΔCTERCC1 =ΔCTERCC1 癌組織-ΔCTERCC1正常，該指標(biāo)的相對(duì)定量值計(jì)算公式為2 -ΔΔCT，計(jì)算的結(jié)果表示為相對(duì)表達(dá)量:即癌組織相對(duì)于正常組織的相對(duì)表達(dá)量，＜1 為表達(dá)降低，＞1 為表達(dá)升高。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:利用計(jì)算機(jī)SPSS 15.0 軟件包進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)描述時(shí)計(jì)數(shù)資料采用率，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;兩組比較時(shí)計(jì)量數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料分析采用Chi-square 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.患者基線特點(diǎn):2012 年6 月～2013 年3 月共入組32 例Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者，其中男性23 例，女性9例，患者平均年齡為60 歲(表1)。

2.有效性和安全性:所有入組患者均完成了至少2 個(gè)周期SOX 方案化療，4 例(12.5%)Ⅲ期患者療效達(dá)到完全緩解(CR)，17 例(53.2%)患者療效達(dá)到部分緩解(PR)，化療有效率為65.7%。9 例(28%)患者病情穩(wěn)定(SD)，2 例(6.3%)患者病情進(jìn)展(PD)。3/4 級(jí)毒性不良反應(yīng)主要為嘔吐(10.8%)，肝功能異常(8.1%)，貧血(5.4%)，中性粒細(xì)胞減少(5.4%)，食欲減退(5.4%)。

3. 手術(shù)和病理結(jié)果:32 例手術(shù)患者中，29 例(90.6%)患者完成D2淋巴結(jié)清掃，3 例(9.4%)患者因腫瘤較晚而只行D1淋巴結(jié)清掃。所有手術(shù)標(biāo)本均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家認(rèn)真進(jìn)行病理檢查，30例(93. 8%)患者術(shù)后標(biāo)本切緣陰性(R0)，2 例(6.2%)患者切緣陽(yáng)性(R1)，10 例(31.3%)患者達(dá)到病理學(xué)緩解。

4.RT-PCR 結(jié)果:32 對(duì)新鮮的腫瘤和正常組織標(biāo)本通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)ERCC1 mRNA 表達(dá)水平(表2)。結(jié)果顯示，ERCC1 mRNA 在組織學(xué)敏感胃癌組織中的表達(dá)低于非敏感患者(P ＜0.01，圖1)。

表1 入組患者基線特點(diǎn)

表2 PCR 引物和探針

圖1 ERCC-1 mRNA 在組織學(xué)敏感胃癌組織中的表達(dá)低于非敏感者

討 論

胃癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的惡性腫瘤性疾病。外科手術(shù)結(jié)合化療是目前進(jìn)展期胃癌治療的主要方法，但總體生存率仍需提高。新型化療藥物的出現(xiàn)能夠提高化療有效率，S -1 是一種口服氟尿嘧啶類藥物，其組成主要由替加氟、吉美嘧啶和奧替拉西鉀，按照1∶0.4∶1 比例結(jié)合而成，是目前單藥治療晚期胃癌有效率最高的化療藥物，文獻(xiàn)報(bào)道其有效率可達(dá)44%。注射用奧沙利鉑屬第3 代鉑類，相比較順鉑具有有效性更好，安全性更好的優(yōu)勢(shì)［9］。近期研究結(jié)果顯示S -1 聯(lián)合奧沙利鉑(SOX 方案)能夠顯著延長(zhǎng)中位總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期，總體有效率為59%，疾病控制率為84%，顯示出此方案的良好療效［10］。但是，臨床工作發(fā)現(xiàn)部分患者經(jīng)化療后仍然出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，原因在于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感度差、特異性不高。因此，如何篩查對(duì)藥物敏感的患者，選擇特異性高的化療方案將是提高胃癌總體治療效果的關(guān)鍵。

本研究中32 例進(jìn)展期胃癌患者經(jīng)2 ～4 個(gè)SOX方案新輔助化療后，21 例患者腫瘤降期，化療有效率為65.6%，疾病控制率為93.7%。10 例患者達(dá)病理學(xué)緩解(2 + 3 級(jí))，其中4 例患者更達(dá)完全緩解(pCR);30 例患者術(shù)后標(biāo)本切緣陰性(R0)，2 例(6.2%)患者切緣陽(yáng)性(R1)，R0根治率為93.8%。此外，所有患者基本可耐受化療，并沒(méi)有出現(xiàn)4 級(jí)毒性不良反應(yīng)。可見(jiàn)進(jìn)展期胃癌新輔助化療不僅是可耐受的、有效的治療方法，同時(shí)未增加手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及術(shù)后并發(fā)癥，還可以降低腫瘤分期，從而提高無(wú)殘存腫瘤(D2/R0)手術(shù)切除率，顯著提高病理緩解率，并降低局部區(qū)域復(fù)發(fā)率，顯著延長(zhǎng)生存期。

本研究結(jié)果顯示ERCC1 mRNA 在病理學(xué)緩解胃癌組織中的表達(dá)低于非緩解者。鉑類藥物的藥理學(xué)機(jī)制主要是形成鉑-DNA 復(fù)合物，通過(guò)引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA 的交聯(lián)，阻礙DNA 合成與復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。DNA 修復(fù)是鉑類藥物耐藥性產(chǎn)生的主要原因。DNA 損傷修復(fù)能力存在以下5 種途徑:核苷酸切除修復(fù)(NER)、同源重組修復(fù)(HRR)、非同源末端連接(NHEJ)、堿基切除修復(fù)(BER)和錯(cuò)配修復(fù)(MRR)。DNA 損傷主要通過(guò)NER 的途徑修復(fù)，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementation 1，ERCC1)是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，參與DNA 鏈的切割和損傷修復(fù)過(guò)程。ERCC1 表達(dá)量直接影響DNA 的修復(fù)，其mRNA 表達(dá)水平與鉑類藥物的敏感度密切相關(guān)。本研究中ERCC1 低表達(dá)患者使用鉑類藥物效果明顯優(yōu)于ERCC1高表達(dá)患者。可見(jiàn)，ERCC1 表達(dá)水平與化療效果呈現(xiàn)相關(guān)性，顯示出ERCC1 在鉑類藥物代謝相關(guān)因子中可能占重要地位，具有成為預(yù)測(cè)化療療效生物標(biāo)志物的潛能。但仍需大樣本試驗(yàn)研究對(duì)于ERCC1 在胃癌化療中的作用進(jìn)行充分論證，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)展期胃癌個(gè)體化治療。

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