芍藥苷對LPS 誘導H9C2 細胞氧化應激損傷的作用

李 金 唐其柱 劉 源 焦 蓉

芍藥苷是一種單萜類糖苷化合物，其藥理作用廣泛，不僅具有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環及抗驚厥等多種生物學效應，還有抗炎、抗氧自由基作用［1］。由此推測，芍藥苷可能對心肌細胞的氧化應激損傷具有改善作用。有研究表明，LPS 侵入機體后不僅參與炎癥反應，還可誘導氧化應激反應的發生［2，3］。因此本實驗就嘗試LPS 刺激H9C2 細胞產生氧化應激損傷反應，來探討芍藥苷對H9C2 細胞氧化應激損傷是否具有保護作用并初步探討其作用機制。

材料與方法

1.藥品及試劑:芍藥苷(上海融禾醫藥科技發展有限公司，100mg，純度＞97%)、胰蛋白酶消化液(Gibco 公司)、新生牛血清(Gibco 公司)、DMEM 培養基(Corning Cellgro 公司)、雙抗(Hyclone 公司)、細胞計數儀(Invitrogen 公司)、流式細胞儀(美國BD FACScalibur 公司)、熒光酶標儀(Synergy HT 公司)、DCFH-DA(碧云天生物技術研究所)。

2.H9C2 細胞的培養:H9C2 細胞購自于中國科學院，用含10%胎牛血清，1%的青霉素(10000U/L)/鏈霉素(10000μg/ml)的DEME 培養基于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱內培養。傳3 ～5 代，待狀態穩定后用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，傳到96 孔培養板上，每次傳代時細胞密度控制在1 ×105/ml，每孔100μl，進行分組實驗。

3.細胞培養分組及CCK8 檢測:(1)觀察不同濃度的芍藥苷藥物刺激對胞內ROS 含量的影響:隨機分為正常對照組和LPS 刺激組。①正常對照組:細胞饑餓18h 后僅給予無血清的培養基處理(下同);②LPS 刺激組:細胞加藥前饑餓18h(下同)，加入10mg/ml 的LPS，處理2h;③芍藥苷組:細胞饑餓后加入50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml 不同濃度的芍藥苷預培養60min，棄去培養基后同時加入與對照組相同濃度的LPS及相對應濃度的芍藥苷。(2)觀察芍藥苷藥物刺激不同時間對胞內ROS 含量的影響:隨機分為正常對照組和芍藥苷組。芍藥苷組:選取上述的一個芍藥苷濃度為100μg/ml，加入LPS及芍藥苷刺激H9C2 細胞不同的時間，加入LPS 前要芍藥苷預培養60min。(3)用流式細胞儀測ROS 陽性細胞數:隨機分為正常對照組、LPS 刺激和芍藥苷組。1)LPS 刺激組:加入10mg/ml LPS，培養2h;2)芍藥苷組:加入相同濃度LPS 及100μg/ml 的芍藥苷藥物，培養相同的時間，加入LPS 前也是芍藥苷預培養60min。

4.CCK8 檢測:向96 孔板中加入100μl 的單細胞懸液，在培養箱預培養24h(37℃、5% CO2)后向培養板加入50、100、200μmol/L 不同濃度的芍藥苷藥物，在培養箱繼續孵育12h，然后向每孔加入10μl CCK8 溶液，再孵育2h，最后用酶標儀測定在450nm 處的吸光度。

5.指標觀測:(1)熒光酶標儀測細胞內ROS 水平:1)按照“細胞培養分組及CCK8 檢測”項中(1)的分組及用實驗因素處理2h 后加入DCFH-DA 探針在37℃培養箱孵育30min，用溫PBS 洗3 次后用熒光酶標儀(激發光波長為485nm，發射光波長為525nm，下同)檢測細胞內DCF 熒光強度，分別以每次實驗的對照組熒光強度作為100%，計算ROS 含量［4］。2)按照“細胞培養分組及CCK8 檢測”項中(2)的分組后，在96 孔黑板里直接加入DCFH-DA 探針，在37℃培養箱孵育30min，用溫PBS 洗3 次，再用上述實驗因素處理不同時間后用熒光酶標儀檢測細胞內DCF 熒光強度，分別以每次實驗的對照組熒光強度作為100%，計算ROS 含量。(2)流式細胞儀檢測ROS 陽性細胞數:細胞接種于六孔板，藥物處理前，先加DCFH-DA 探針在培養箱孵育30min，將細胞懸于PBS 中，用細胞計數儀使細胞數調整到1 ×106個，離心收集細胞，溫PBS洗3 遍。1ml PBS 重懸，上機檢測，使用488nm 激發波長，525nm 發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強度(DCF 的熒光光譜和FITC 非常相似，可以用FITC 的參數設置檢測DCF)，各組細胞碎片均通過設門除去，結果用熒光細胞即ROS 陽性細胞百分率表示，重復3 次。

6.統計學方法:應用SPSS 17. 0 統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，本組間計量資料使用One-way ANOVA 法分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.芍藥苷對H9C2 細胞活力的影響:正常對照組細胞存活率為100%，則芍藥苷在50、100、200μg/ml 濃度的細胞毒性活力分別為95. 1%、112.9%、110.2%，因此本實驗設計的芍藥苷濃度具有低細胞毒性，為了排除芍藥苷對H9C2 細胞的毒性損傷而帶來的影響細胞存活率，及干擾實驗結果，本實驗采用50、100、200μmol/L 作為本實驗的藥物濃度，詳見表1。

表1 不同濃度的芍藥苷刺激H9C2 細胞的細胞毒性活力(±s，n=6)

表1 不同濃度的芍藥苷刺激H9C2 細胞的細胞毒性活力(±s，n=6)

與對照組相比，* P ＜0.05

組別 劑量(μmol/ml) OD 值(450nm) 細胞存活率(%)1.14 ±0.09 100.0芍藥苷組Ⅰ 50 1.29 ±0.06* 112.9芍藥苷組Ⅱ 100 1.26 ±0.06* 110.2芍藥苷組Ⅲ對照組0 200 1.09 ±0.06 95.1

2.芍藥苷隨著藥物濃度對細胞內ROS 水平的影響:LPS 刺激H9C2 細胞120min 后，胞內ROS 量明顯上升，與對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05);加入50μg/ml 的芍藥苷后胞內ROS 的量下降，隨著藥物濃度的增加，胞內ROS 下降趨勢更明顯，且與LPS 組相比差異有統計學意義(P ＜0.05)，詳見表2。

表2 不同濃度芍藥苷藥物刺激H9C2 細胞產生的ROS 水平(±s，n=6)

表2 不同濃度芍藥苷藥物刺激H9C2 細胞產生的ROS 水平(±s，n=6)

與LPS 組相比，* P ＜0.05;△濃度單位為毫克/毫升(mg/ml)

組別 劑量(μmol/ml)ROS 的含量與對照組比較(%)對照組 - 100.00 ±5.32*LPS 組 10△ 222.23 ±9.24 LPS+芍藥苷組Ⅰ 50 191.20 ±8.74*LPS+芍藥苷組Ⅱ 100 173.19 ±2.97*LPS+芍藥苷組Ⅲ 200 145.40 ±9.89*

3. 芍藥苷隨著時間對胞內ROS 水平的影響:加入LPS 30min 后胞內ROS 含量開始上升，刺激120min 后胞內ROS 含量上升更明顯，與對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05);加入芍藥苷藥物刺激后，胞內ROS 都有不同程度的降低，當刺激足夠的時間胞內ROS 下降明顯低于LPS 組，且差異有統計學意義(P ＜0.05)，詳見表3。

表3 LPS 與芍藥苷藥物刺激H9C2 細胞不同時間胞內ROS 水平(±s，n=6)

表3 LPS 與芍藥苷藥物刺激H9C2 細胞不同時間胞內ROS 水平(±s，n=6)

LPS 組與對照組相比，* P ＜0.05;LPS + 芍藥苷組與LPS 組相比，#P ＜0.05

組別 時間(min) ROS 的含量與對照組比較(%)30 100.00 ±5.25 LPS 組Ⅰ 30 224.35 ±6.35*LPS+芍藥苷組Ⅰ 30 208.00 ±8.25 LPS 組Ⅱ 60 245.72 ±7.42*LPS+芍藥苷組Ⅱ 60 211.14 ±9.88#LPS 組Ⅲ 120 272.94 ±11.41*LPS+芍藥苷組Ⅲ 120 161.28 ± 9.58對照組#

4. 流式細胞儀測定胞內ROS 水平:LPS 刺激H9C2 細胞2h 后，與對照組相比ROS 陽性細胞百分率明顯增加，且差異有統計學意義(P ＜0.05);加入LPS 與芍藥苷藥物刺激相同的時間后，ROS 陽性細胞百分率與LPS 組相比明顯下降，且(P ＜0.05)。

表4 不同處理因素刺激H9C2 細胞2h 對ROS 產生的影響(±s，n=3)

表4 不同處理因素刺激H9C2 細胞2h 對ROS 產生的影響(±s，n=3)

與對照組相比，* P ＜0.05;LPS +芍藥苷組與LPS 組相比，#P ＜0.05

組別 ROS 陽性細胞百分率(%)1.98 ±2.14 LPS 組 3.30 ±1.81*LPS+芍藥苷組 2.36 ±3.06*#對照組

討 論

本研究發現，LPS 刺激H9C2 細胞30min 胞內ROS 水平開始上升，誘導細胞進入氧化應激狀態，隨著刺激時間的增加，胞內ROS 上升趨勢更明顯，且細胞培養時在光鏡下也可觀察到大量的細胞碎片、皺縮細胞，這都表明10mg/ml 的LPS 可以誘導H9C2 細胞出現氧化應激損傷反應。

本研究還發現，用LPS 與不同濃度的芍藥苷藥物刺激H9C2 細胞后，胞內ROS 含量明顯低于LPS組(P ＜0.05)，且下降趨勢呈現濃度依賴性。LPS 與芍藥苷藥物共同刺激H9C2 細胞不同時間，胞內ROS含量明顯低于相應的LPS 組(P ＜0.05)，且下降趨勢呈現時間依賴性。芍藥苷能夠降低胞內超負荷ROS的含量，這提示芍藥苷藥物能夠改善H9C2 細胞氧化應激損傷。分析結果，我們推測芍藥苷藥物可能通過以下作用機制來改善氧化應激損傷:①抑制胞內氧自由基的產生及增加清除氧自由基的活性酶，當芍藥苷藥物達到適當的濃度及時間干預，可抑制胞內氧自由基的產生及增加清除氧自由基的活性酶，最終使胞內超負荷的ROS 明顯下降［5］;②穩定細胞膜通透性，平衡離子通道使細胞高分子物質如核酸、蛋白質等免受氧自由基的破壞，減輕細胞的損傷與死亡［6］;③抑制炎癥的發生，通過抑制LPS 的刺激而阻斷因炎癥誘發更多的氧化應激損傷反應［7］。

現代醫學研究證實芍藥苷具有抑制腫瘤細胞增殖、調節免疫功能及保護神經細胞的作用［8］。本實驗證實芍藥苷對H9C2 細胞氧化應激損傷具有改善作用。近年來氧化應激與心肌肥厚的關系受到了國內外越來越多學者的關注，大量文獻也證實了氧化應激與心肌肥厚的形成密切相關［9］。本實驗為我們應用芍藥苷改善心肌細胞氧化應激損傷進而有效抑制心肌肥厚提供了理論依據，但本實驗只是檢測了活性氧指標，而未檢測心肌肥厚相關的指標，且未涉及動物在體實驗的部分，因此存在一定的局限性。

綜上所述，本研究通過LPS 誘導H9C2 細胞氧化應激損傷觀察到芍藥苷對H9C2 細胞低毒性，可降低胞內ROS 的水平，具有改善H9C2 細胞氧化應激損傷的作用。希望以后可以進一步深入研究其作用機制及作用途徑，為芍藥苷防治心肌肥厚展示更廣闊的前景。

1 金英善，陳曼麗，陶俊. 芍藥化學成分和藥理作用研究進展［J］. 中國藥理學與毒理學雜志，2013，27(4):745 -749

2 Qiao Y，Bai XF，Du YG. Chitosan oligosaccharides protect mice from LPS challenge by in RAW attenuation of inflammation and oxidative stress［J］.International Immunopharmacology，2011，11(1):121 -127

3 Park CM，Park JY，Noh KH，et al.Taraxacum officinale Weber extracts inhibit LPS - induced oxidative stress and nitric oxide production via the NF-κB modulation in RAW 264.7 cells［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，133(2):834 -842

4 曾曉鋒，段曉飛，張晶，等. MA 與HIV -Tat 協同作用致大鼠相關腦區ROS、GSH-PX 和SOD 的變化［J］. 中國法醫學雜志，2012，26(6):431 -437

5 相湘，胡旭光，張思為. 芍藥苷對腦缺氧和缺血再灌注損傷的改善作用研究［J］.中國現代藥物應用，2008，2(17):58 -60

6 鄭世存，李曉宇，歐陽兵，等. 芍藥苷藥理作用研究新進展［J］. 中國藥物警戒，2012，9(2):100 -103

7 朱江愛，方步武，吳咸中，等. 芍藥甘草湯的抗炎作用研究［J］. 天津醫藥，2009，37(2):120 -123

8 王國峰，陳冬梅. 芍藥苷誘導藥理預適應抗腦缺血的神經保護作用［J］. 中國臨床藥理學與治療學，2007，12(5):504 -511

9 顧玉梅，吳揚. 氧化應激在心肌肥厚中的作用及其機制［J］. 南通大學學報:醫學版，2005，25(3):233 -235