Fenton體系的優(yōu)化及其對(duì)酪蛋白的氧化作用

劉建壘，景 浩*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 10 0083）

Fenton體系的優(yōu)化及其對(duì)酪蛋白的氧化作用

劉建壘，景 浩*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 10 0083）

酪蛋白是乳與乳粉中的主要蛋白組分，在加工和貯藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)。研究Fenton體系誘導(dǎo)的酪蛋白氧化后化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性的變化。首先對(duì)Fenton體系中Fe2+濃度、抗壞血酸（ascorbic acid，Asc）濃度、H2O2濃度進(jìn)行了優(yōu)化，以酪蛋白為靶分子，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究了Fenton體系主要成分以及體系的溫度和時(shí)間對(duì)酪蛋白氧化程度的影響；并進(jìn)一步研究了氧化后酪蛋白的溶解性、變性程度、總巰基含量及羰基含量的變化。結(jié)果表明：當(dāng)Fenton體系中Fe2+濃度為0.8 mmol/L，EDTANa2濃度為1 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L，Asc濃度為0.8 mmol/L，酪蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，37 ℃條件下加熱4 h時(shí)，酪蛋白氧化程度最明顯。隨著Fe2+濃度、Asc濃度、H2O2濃度、氧化溫度的升高和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白4 個(gè)組分條帶的密度均逐漸減小，并在相應(yīng)的高分子區(qū)域出現(xiàn)逐漸致密的新條帶；但隨著酪蛋白質(zhì)量濃度的升高，酪蛋白條帶的變化減小。酪蛋白氧化后，其溶解度和巰基含量顯著降低，變性程度和羰基含量顯著升高。綜上所述，酪蛋白氧化后發(fā)生蛋白交聯(lián)和氨基酸功能基團(tuán)變化，導(dǎo)致蛋白的變性程度增大以及溶解度下降。

酪蛋白；Fenton體系；氧化；優(yōu)化；化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性

酪蛋白是牛奶蛋白的主要組分，約占乳中蛋白的80%[1]。酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白4 個(gè)組分組成，在脫脂乳中的含量分別為12～15、3～4、9～11、2～4 g/L[2]。乳中酪蛋白是以膠體粒子的形式存在，直徑在50～600 nm（平均直徑約為150 nm），又被稱為“酪蛋白膠束”（casein micelles）[3]。酪蛋白含有較多的磷酸殘基，易與鈣離子結(jié)合形成膠體磷酸鈣，有助于維持酪蛋白膠束的穩(wěn)定性[4]。酪蛋白在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，添加酪蛋白有助于增加食品的風(fēng)味，還可以改善產(chǎn)品的乳化性、攪打性、保水性及黏度等特性[4]。其中αs-酪蛋白和β-酪蛋白有助于維持熱加工過(guò)程中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并防止蛋白質(zhì)的聚集、沉淀和凝膠[5]，對(duì)乳飲料加工具有重要意義。

乳制品在加工及貯藏過(guò)程中可發(fā)生蛋白氧化，影響產(chǎn)品的品質(zhì)。目前采用的乳蛋白氧化體系有類Fenton體系（Fe3+-H2O2-Asc）[6]、核黃素誘導(dǎo)的光氧化[7]、紫外線照射[8-9]、乳過(guò)氧化物酶體系（lactoperoxidase-H2O2）[10]及多不飽和脂肪酸光氧化體系[11]等。乳蛋白氧化后其顏色加深[9]，蛋白溶液混濁度升高，巰基含量減少[6]，羰基含量增加[6-7,11]，二酪氨酸含量增加[6,10]，表面疏水性增大[6]。乳蛋白氧化后，其構(gòu)象發(fā)生變化，容易被胃蛋白酶水解[8]；還會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)，生成二聚體或多聚體[6-7,9,11]。氧化作用還可以使芳香族氨基 酸生成N-甲酰犬尿氨酸或二酪氨酸[8]。總之，氧化反應(yīng)不僅使乳蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，還會(huì)造成乳蛋白的功能特性及流變學(xué)特性發(fā)生變化，如乳清蛋白的溶解性降低，蛋白凝膠的硬度及彈性下降，但乳化性和起泡性等表面特性有所改善[12]。

Fenton試劑指的是亞鐵鹽和過(guò)氧化氫的組合，是由英國(guó)人Fenton在1894年首先研究報(bào)道的，其實(shí)質(zhì)是H2O2在Fe2+的催化作用下生成具有高反應(yīng)活性的羥自由基（·OH）[13]。之后研究發(fā)現(xiàn)其他金屬離子，如Fe3+、Cu+、Ti3+、Cr2+、Co2+等，也具有Fenton試劑的氧化特性，被稱為類Fenton試劑[14]。加入抗壞血酸能夠?qū)e3+還原為Fe2+，進(jìn)而加快Fenton體系產(chǎn)生·OH的速率[15]。以往的研究主要集中在蛋白氧化后結(jié)構(gòu)及功能特性的改變等方面，對(duì)Fenton體系主要成分的使用濃度的報(bào)道差異較大。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的Fenton體系多為Fe3+-H2O2-Asc體系，但其中各組分使用的濃度不同，F(xiàn)e3+濃度范圍在0.01～0.1 mmol/L間，Asc濃度在0.1～1 mmol/L間，H2O2濃度在0.5～20 mmol/L間，在這些條件下均可以導(dǎo)致乳清蛋白或肌動(dòng)球蛋白的氧化交聯(lián)[6,16-17]。也有報(bào)道采用Fe2+-H2O2體系，其中采用Fe2+濃度為40、80 μmol/L或2.5 mmol/L，H2O2濃度為0.8、50 mmol/L，它們均可導(dǎo)致色氨酸或牛血清白蛋白的氧化[18-19]。而對(duì)Fenton體系（Fe2+-H2O2-Asc）中Fe2+、H2O2、Asc的濃度對(duì)酪蛋白氧化的影響未見報(bào)道，因此Fenton體系中各組分濃度對(duì)酪蛋白氧化的影響研究不但可對(duì)蛋白氧化的實(shí)驗(yàn)研究提供參考，還對(duì)控制蛋白氧化的條件提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)Fenton體系中影響酪蛋白氧化的主要因素進(jìn)行了研究，包括Fenton體系中Fe2+濃度、Asc濃度、H2O2濃度，及體系的作用溫度和時(shí)間、以及酪蛋白本身的濃度對(duì)酪蛋白氧化程度的影響；并進(jìn)一步研究了氧化后化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性的變化，包括酪蛋白的溶解性、變性程度、總巰基含量及羰基含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白（casein，CN）、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-ddithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB）美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）第Ⅴ組分 美國(guó)Amresco公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 國(guó)藥集團(tuán)；L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，Asc） 西隴化工股份有限公司；蛋白染色液（dye reagent concentrate，DRC）美國(guó)Bio-Rad公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker（含6 種標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分子質(zhì)量從大到小依次為：兔磷酸化酶B 97.4 ku、牛血清白蛋白66.2 ku、兔肌動(dòng)蛋白43 ku、牛碳酸酐酶31 ku、人生長(zhǎng)激素22 ku、雞蛋清溶菌酶14.4 ku） 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C+酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；68 0型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；HY-2A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器、HJ-1磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；CU-420型電熱恒溫水箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B 臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1200型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的氧化

參考程恒等[20]的方法，簡(jiǎn)述如下，用pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）（含NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4的濃度分別為137、2.7、10、2 mmol/L）配制各儲(chǔ)備液，向50 mL離心管中依次加入0.05～0.5 mL 20 mmol/L的FeSO4溶液、0.5 mL 20 mmol/L的EDTANa2溶液、0.05～2 mL 100 mmol/L的 H2O2溶液、0.05～0.5 mL 20 mmol/L的Asc溶液，迅速加入0.8～8 mL 12.5 mg/mL的酪蛋白溶液，加PBS至體積為10 mL，徹底混勻（溶液體系共10 mL，其中酪蛋白質(zhì)量濃度為1～10 mg/mL，F(xiàn)eSO4為0.1～1.0 mmol/L，EDTANa2為1 mmol/L，H2O2為0.5～20 mmol/L，Asc為0.1～1.0 mmol/L）。將樣品迅速均勻分裝到2 個(gè)15 mL離心管中，分別放入25、37 ℃水浴條件下進(jìn)行氧化反應(yīng)。分別在2、4、6 h時(shí)取出一組樣品并將各溶液放入－20 ℃冰箱中冷凍，待測(cè)。同時(shí)以未氧化的酪蛋白溶液作空白對(duì)照。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參考J i n g H a o等[21]的方法，簡(jiǎn)述如下，用SDS-PAGE對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。依次在凝膠板中加入7 mL的15 g/100 mL分離膠和2 mL的5 g/100 mL濃縮膠，凝膠厚度1.5 mm。將蛋白樣品溶液預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)化為2 mg/mL，取20 ?L樣品溶液與20 ?L上樣緩沖液（含2 g/100 mL SDS和2%（V/V）β-巰基乙醇，40%（V/V）甘油，0.02 g/100 mL溴酚藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液，pH 6.8）混勻，80 ℃水浴加熱5 min，上樣量為10 ?L，用DYY-8C型電泳儀進(jìn)行穩(wěn)壓電泳，起始電壓為80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠與濃縮膠交界處時(shí)，將電壓調(diào)到110 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑跑到距膠底部5 mm時(shí)（約1.5 h），停止電泳。剝下膠片后，用0.025 g/100 mL考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（甲醇、乙酸、水體積比5∶1∶4）染色6 h，用脫色液（甲醇、乙酸、水體積比2∶1∶7）脫色至條帶清晰可見，用凝膠成像儀拍照，分析。

非還原SDS-PAGE中上樣緩沖液中不加β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME），其他同上。

1.3.3 蛋白溶解度的測(cè)定

參考Daimer等[22]的方法，簡(jiǎn)述如下，蛋白質(zhì)溶解度用離心后樣品上清液中蛋白質(zhì)含量與樣品總蛋白質(zhì)含量的之比表示。測(cè)定前將樣品用含有PBS緩沖溶液稀釋至蛋白質(zhì)含量為5 mg/mL，室溫下緩慢攪動(dòng)1 h，使體系充分平衡。先取部分懸浮液用于測(cè)定總蛋白質(zhì)含量（total protein content，Pt），再將剩余的溶液在10 000×g條件下離心10 min。不溶物沉淀在管底，上清液中蛋白為可溶性蛋白，測(cè)定其含量（soluble protein content，Ps）。蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測(cè)定。溶解度計(jì)算見公式（1）。

1.3.4 蛋白變性程度的測(cè)定

參考Daimer等[23]的方法，簡(jiǎn)述如下，測(cè)定前將樣品用PBS緩沖溶液稀釋至蛋白質(zhì)含量為5 mg/mL，室溫下緩慢攪動(dòng)1 h，使體系充分平衡。同時(shí)，用10 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將酪蛋白溶液的pH值調(diào)至8.0。先取部分蛋白溶液用于測(cè)定總蛋白質(zhì)含量（Pt），再將剩余的溶液在10 000×g條件下離心10 min。不溶物沉在管底，上清液包含可溶性物質(zhì)用以測(cè)定蛋白含量（Ps），蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測(cè)定。變性程度計(jì)算見公式（2）。

1.3.5 總巰基含量的測(cè)定

參考Aitken等[24]的方法，簡(jiǎn)述如下，所需儲(chǔ)備液1）反應(yīng)緩沖液：含1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L PBS， pH 8.0；2）變性緩沖液：含6 mol/L 鹽酸胍，1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L Na2HPO4的緩沖溶液pH 8.0；3）Ellman’s溶液：用反應(yīng)緩沖液配制10 mmol/L（4 mg/mL）的DTNB，新鮮配制。

用反應(yīng)緩沖液配制濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，將樣品溶液調(diào)pH值至8.0。準(zhǔn)備一套離心管，分別加入20 μL的Ellman’s試劑溶液和1 mL的變性緩沖液，再依次加入100 μL的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液。混勻，室溫下暗處放置15 min后，以反應(yīng)緩沖液為參比，測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)其吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到樣品溶液的總巰基含量。

1.3.6 羰基含量的測(cè)定

參考Wehr等[25]的方法，簡(jiǎn)述如下，取0.4 mL的蛋白樣品溶液于1.5 mL離心管中，加入0.4 mL 0.2% DNPH溶液（含2 mol/L HCl），漩渦振蕩，充分混勻，對(duì)照組加入0.4 mL 2 mol/L的HCl，其余操作相同；將混合液在室溫下避光放置10 min，每2 min漩渦振蕩1 次。加入0.2 mL 100 g/100 mL三氯乙酸（體系中最終含量為20 g/100 mL），2 000×g離心2 min，小心去除上清液；加入1 mL的乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液，漩渦振蕩，使蛋白分散，立即在5 000×g離心2 min，去除上清液，如此洗滌沉淀3 次以除去游離的DNPH；再將所得沉淀溶解在1 mL 6 mol/L的鹽酸胍（含20 mmol/L K3P O4，pH 2.5）溶液中，37 ℃水浴15 min，使蛋白質(zhì)完全溶解，6 000×g離心3 min。以6 mol/L的鹽酸胍（含20 mmol/L K3PO4，pH 2.5）為空白，在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)上清液吸光度，并用Bradford法測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)的含量。羰基含量按朗伯比爾定律計(jì)算，見公式（3）。

式中：ΔA為樣品A370nm－對(duì)照A370nm；ζ為產(chǎn)物腙的摩爾吸光系數(shù)，在此溶液中值為22 000 L/（mol?cm）；b為比色皿光徑/cm；c為羰基含量，羰基含量用nmol/mg pro表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe2+濃度對(duì)酪蛋白氧化的影響

酪蛋白含4 個(gè)條帶，從上到下依次為αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，由于αs2-酪蛋白和αs1-酪蛋白的分子質(zhì)量比較接近，故這兩個(gè)條帶區(qū)分并不明顯（圖1A1）。氧化后，酪蛋白4 個(gè)組分的條帶密度均減小，并在高分子區(qū)域出現(xiàn)新條帶，且Fenton體系中Fe2+濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍時(shí)，隨Fe2+濃度的增大、氧化溫度的升高及氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白4 個(gè)組分條帶的密度均逐漸減小，并在相應(yīng)的高分子區(qū)域出現(xiàn)逐漸致密的新條帶（圖1）。在37 ℃條件下反應(yīng)4 h后，F(xiàn)e2+濃度為0.8 mmol/L時(shí)，高分子區(qū)域條帶密度顯著增加，在非還原電泳圖譜中，相對(duì)應(yīng)的條帶有部分蛋白聚集在點(diǎn)樣孔，而未進(jìn)入濃縮膠（圖1B2）；而在還原電泳圖譜中，點(diǎn)樣孔處的蛋白含量增加不明顯（圖1A2）。圖1B1、1B2與圖1A1、1A2對(duì)比還可以看出，非還原電泳的電泳圖譜要比還原電泳的電泳圖譜少1 條分子質(zhì)量較小的條帶，即κ-酪蛋白缺失。

圖1 Fe 1 Fe2+2+對(duì)酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜EFig.1 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of Fe2+

酪蛋白的組成中αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白各自含有兩個(gè)—SH基團(tuán)，由于兩分子間的二硫鍵的作用，天然的αs2-酪蛋白大多以二聚體的形式存在，而天然的κ-酪蛋白則是以一系列由二硫鍵形成的多聚體的形式存在[26-27]。此外，αs1-和β-酪蛋白均可和κ-酪蛋白形成復(fù)合物[28]。酪蛋白的還原電泳圖譜中多了1 個(gè)條帶，是因?yàn)榧尤氲摩?巰基乙醇能將聚合狀態(tài)的κ-酪蛋白中的二硫鍵斷裂，形成κ-酪蛋白單體的緣故。酪蛋白氧化后發(fā)生交聯(lián)或聚集，分子質(zhì)量增大；但在還原電泳圖譜中，點(diǎn)樣孔處的蛋白含量增加不明顯，是因?yàn)榧尤氲摩?巰基乙醇能將產(chǎn)生的交聯(lián)蛋白中的二硫鍵還原，從而降低了其分子質(zhì)量；而在還原電泳圖譜中仍然存在較多的高分子區(qū)域新條帶，可能是酪蛋白中的酪氨酸通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成二酪氨酸產(chǎn)生的交聯(lián)蛋白[6,29]，且有研究表明二酪氨酸主要是由α-酪蛋白和β-酪蛋白的氧化生成的[7,30]。Samagoto等[9]研究認(rèn)為牛奶濃縮蛋白粉在紫外光氧化作用下產(chǎn)生的高分子質(zhì)量蛋白聚合物主要是由于酪蛋白氧化產(chǎn)生的非二硫鍵共價(jià)交聯(lián)；而Wang Yaosong等[16]認(rèn)為乳清蛋白在Fenton體系中氧化后發(fā)生的交聯(lián)主要是通過(guò)二硫鍵的形式產(chǎn)生的，本研究結(jié)果與前者更符。

2.2 H2O2對(duì)酪蛋白氧化的影響

圖 22 HH2O2對(duì)酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of H2O2

根據(jù)Asc濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在Asc 0.8 mmol/L的條件下研究了H2O2濃度在0.5～20 mmol/L時(shí)酪蛋白氧化程度的影響。結(jié)果表明，隨H2O2濃度的增大、氧化溫度的升高和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白各條帶密度逐漸減少，高分子區(qū)域條帶密度逐漸增加（圖2），且變化程度比不同濃度的Fe2+、Asc的影響更顯著。當(dāng)H2O2濃度小于1 mmol/L時(shí)，產(chǎn)生的羥自由基較少，對(duì)酪蛋白的氧化作用較小；當(dāng)H2O2濃度大于5 mmol/L后，隨H2O2濃度的增大，產(chǎn)生的羥自由基數(shù)量增加，對(duì)酪蛋白的氧化作用加大；其中在H2O2濃度為10 mmol/L時(shí)，氧化4 h后，酪蛋白的非還原電泳圖譜中，有大量蛋白聚集在點(diǎn)樣孔，而未進(jìn)入濃縮膠（圖2B1、2B2），表明酪蛋白發(fā)生了部分交聯(lián)或聚集，分子質(zhì)量增大；而當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時(shí)，酪蛋白溶液變得十分混濁，并產(chǎn)生部分沉淀，溶液中的蛋白含量急劇下降。

H2O2是Fenton體系產(chǎn)生羥自由基的直接來(lái)源，故其濃度對(duì)蛋白氧化的影響非常大。Cui Xuhai等[6]研究結(jié)果也表明H2O2濃度大于5 mmol/L時(shí)乳清蛋白氧化產(chǎn)生明顯的交聯(lián)，H2O2濃度為20 mmol/L時(shí)溶液混濁度（A600nm）最大，且蛋白含量急劇減少，本研究與其結(jié)果是一致的。

2.3 Asc對(duì)酪蛋白氧化的影響

圖3 Asc對(duì)酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of Asc

在Fenton體系中，研究了在H2O2為20 mmol/L 條件下，Asc濃度的變化（0.1～1.0 mmol/L）對(duì)酪蛋白氧化程度的影響。結(jié)果顯示，Asc濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)，隨Asc濃度的增大、氧化溫度的升高和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白4 個(gè)組分的條帶密度均逐漸減少，高分子區(qū)域條帶密度逐漸增加（圖3），表明酪蛋白的氧化程度逐漸加劇。在37 ℃條件下加熱4 h后，當(dāng)Asc濃度為0.8 mmol/L時(shí)，酪蛋白含量開始明顯減少，且高分子區(qū)域條帶密度增加（圖3A2）；但在非還原電泳圖譜中，相對(duì)應(yīng)的條帶有部分蛋白聚集在點(diǎn)樣孔，而未進(jìn)入濃縮膠（圖3B2），表明酪蛋白發(fā)生了部分交聯(lián)或聚集，分子質(zhì)量增大。氧化6 h后，酪蛋白4 個(gè)組分的含量均明顯減少，高分子區(qū)域條帶密度明顯增加，且有大量的蛋白聚集在點(diǎn)樣孔，氧化作用非常明顯。

Nappi等[31]的研究證實(shí)Asc濃度在0.1～0.2 mmol/L時(shí)，能夠促進(jìn)金屬離子的再生，進(jìn)而使Fenton體系中H2O2能在Fe2+的催化作用下產(chǎn)生更多的羥自由基。此外，由于Asc在溶液中呈酸性，而Kremer[32]研究發(fā)現(xiàn)Fenton體系在較低pH值時(shí)O2的釋放量減少，也就是說(shuō)Asc濃度增大時(shí)，F(xiàn)enton體系的pH值降低，H2O2分解產(chǎn)生的O2減少，從而有更多的H2O2參與產(chǎn)生羥自由基的反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了酪蛋白的氧化。

2.4 酪蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酪蛋白氧化的影響

圖4 酪蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of casein

隨酪蛋白質(zhì)量濃度的增大，酪蛋白各條帶密度逐漸增加，高分子區(qū)域條帶密度逐漸減少（圖4），表明酪蛋白的氧化程度逐漸減弱。當(dāng)酪蛋白質(zhì)量濃度低于5 mg/mL時(shí)，37 ℃氧化4 h后，酪蛋白的非還原電泳圖譜中，均有大量蛋白聚集在點(diǎn)樣孔，而未進(jìn)入濃縮膠（圖4B2）；當(dāng)酪蛋白質(zhì)量濃度大于8 mg/mL時(shí)，氧化生成的高分子質(zhì)量聚合物的含量開始減少，氧化作用有所減弱。表明酪蛋白在低質(zhì)量濃度時(shí)更容易被氧化，且隨氧化溫度的升高和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，氧化程度均逐漸加劇。

由于酪蛋白是牛奶各組分中起抗氧化作用的主要蛋白[33]，在確定的體系中，F(xiàn)enton體系產(chǎn)生羥自由基的數(shù)量是一定的，當(dāng)體系中酪蛋白質(zhì)量濃度增大時(shí)，能夠清除部分自由基，從而減少羥自由基對(duì)酪蛋白本身的氧化損傷。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)enton體系中酪蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，F(xiàn)eSO4濃度為0.8 mmol/L，EDTANa2濃度為1 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L，Asc濃度為0.8 mmol/L，37 ℃條件下加熱4 h對(duì)酪蛋白的氧化作用非常明顯。

本研究采用Fe2+-H2O2-Asc體系，其中Fe2+濃度為0.8 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L，比Utrera等[18]采用的Fe2+-H2O2體系（含40或80 μmol/L Fe2+，0.8 mmol/L H2O2）中的Fe2+和H2O2的濃度都要高；但比Bian Chunli等[19]研究的Fe2+-H2O2體系（含2.5 mmol/L Fe2+，50 mmol/L H2O2）中的Fe2+和H2O2的濃度都要低。本研究?jī)?yōu)化得到的Asc濃度為0.8 mmol/L，比Cui Xuhai等[6]采用的Fe3+-H2O2-Asc體系（含0.1 mmol/L Asc）中的Asc的濃度高，但比Wang Yaosong等[16]研究的Fe3+-H2O2-Asc體系（含1 mmol/L Asc）中的Asc濃度低。本研究的反應(yīng)溫度為37 ℃，比上述4 項(xiàng)研究中采用的室溫條件也要高；本研究需要的酪蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，比Cui Xuhai等[6]研究的乳清蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL低很多，這可能與酪蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化作用有關(guān)。

乳與乳粉中均含有一定量的鐵及抗壞血酸，但其含量較本實(shí)驗(yàn)中采用的濃度低，在H2O2存在下仍會(huì)發(fā)生Fenton反應(yīng)，導(dǎo)致乳蛋白的氧化。因此在乳與乳粉的貯藏及加工過(guò)程中應(yīng)盡量避免接觸H2O2等氧化劑。

2.5 酪蛋白氧化對(duì)化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性的影響

表1 酪蛋白氧化對(duì)化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性的影響Table 1 Changes in chemical and structural properties of casein after oxidattiioonn

由表1可知，酪蛋白氧化后溶解度下降了28.4%，變性程度增加了6.4 倍，總巰基含量下降了41.9%，羰基含量增加了近10 倍，進(jìn)一步表明酪蛋白在Fenton體系中很容易被氧化。

本研究的結(jié)果與Cui Xuhai等[6]研究的乳清蛋白的各氧化指標(biāo)的變化趨勢(shì)一致，但本研究采用的Fenton體系對(duì)蛋白氧化更敏感。氧化后酪蛋白總巰基的含量減少，這是因?yàn)槔业鞍椎慕M成中αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白各自含有兩個(gè)—SH基團(tuán)[26-27]，在Fenton體系中很容易被氧化發(fā)生交聯(lián)，這與SDS-PAGE的結(jié)果是一致的。α-酪蛋白和β-酪蛋白是無(wú)規(guī)則卷曲蛋白，最容易被氧化形成羰基，其中色氨酸、組氨酸，蛋氨酸中的羰基含量增加明顯[7]。此外，賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸的氧化也可形成羰基[29-30]。

3 結(jié) 論

在Fenton體系中，增加Fe2+、H2O2及Asc濃度的均能促進(jìn)酪蛋白的氧化；升高溫度及延長(zhǎng)氧化時(shí)間也能促進(jìn)酪蛋白的氧化；但當(dāng)酪蛋白質(zhì)量濃度增高時(shí)，體系對(duì)酪蛋白的氧化作用減弱。酪蛋白氧化后發(fā)生交聯(lián)生成蛋白聚合物；氧化還造成酪蛋白的氨基酸功能基團(tuán)發(fā)生變化，如巰基含量減少，氨基酸殘基氧化生成羰基，這些可導(dǎo)致酪蛋白的變性程度增大以及溶解度下降。本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響酪蛋白氧化的因素的研究，為有效地控制乳蛋白在貯藏及加工過(guò)程中的氧化反應(yīng)及減少產(chǎn)品品質(zhì)劣變提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

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Optimization of Fenton Reaction System and Its Inductive Effect on Casein Oxidation

LIU Jian-lei, JING Hao*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Casein consists of about 80% of the proteins of milk or milk powder, which is susceptible to oxidation during food processing and storage. Fenton reaction-induced casein oxidation and the associated chemical and structural changes were investigated. The effects of the main components in the Fenton reaction system as well as reaction temperature and time on casein oxidation were investigated by using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the conc entrations of Fe2+, ascorbic acid, and H2O2were optimized. Fenton reaction-induced casein oxidation and its chemical and structural changes were assessed by changes in solubility, degree of protein denaturation, and total sulfhydryl and carbonyl contents of casein. Results showed that casein was oxidized to a great degree in the Fenton system containing 0.8 mmol/L FeSO4, 1 mmol/L EDTANa2, 10 mmol/L H2O2, 0.8 mmol/L ascorbic acid, 5 mg/mL casein after incubation at 37 ℃ for 4 h. The electrophoretic patterns indicated decreases in band intensity of casein and increases in density of the high molecular weight (HMW) protein bands. These changes were greater with increasing concentrations of Fe2+, ascorbic acid, and H2O2in the Fenton reaction sy stem as well as temperature and time. Smaller changes in the casein bands were seen with increasing its concentration. Solubility and total sulfhydryl content were decreased, and degree of protein denaturation and carbonyl content were increased after oxidization of casein. In conclusion, casein oxidation leads to cross-linking into high molecular weight (HMW) substances and modification of functional groups of amino acid residues, which consequently results in decreased protein solubility and increased protein denaturation degree.

casein; Fenton reaction system; oxidation; optimization; chemical and structural properties

TS252.1

A

1002-6630（2014）13-0074-07

10.7506/spkx1002-6630-201413014

2014-06-15

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD09B0302）

劉建壘（1987—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槿榈鞍椎钠焚|(zhì)控制。E-mail：liujianlei@cau.edu.cn

*通信作者：景浩（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榉肿訝I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：haojing@cau.edu.cn