鐵蛋白：一種新型礦質元素營養強化劑載體

李美良，蒲 彪*，趙廣華

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

人和動物每天都需要一定量的礦物質營養元素來滿足身體各項活動的代謝需要，礦物質元素攝入量長期不足，就會導致各種疾病的發生。體內容易缺乏的礦物質營養元素既有常量元素，如鈣（Ca）元素，也有微量元素，如鐵（Fe）、鋅（Zn）以及硒（Se）等。這些元素對于維持身體正常機能具有重要作用。

鐵是人體必需的半微量元素，可以形成血紅素、鐵硫原子簇以及非血紅素鐵化合物，這使得它在光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白質和核酸的合成等諸多生理代謝過程扮演著舉足輕重的角色。其在人和動物體內具有重要的生物學功能，如鐵參與血紅蛋白、肌紅蛋白在的合成，使氧和養分在體內正常運輸、儲存；它能構成細胞色素酶及過氧化氫酶等，參與機體電子傳遞，對呼吸和能量代謝都產生重要影響[1-3]。鐵在體內過少或者過多都會對機體產生不良影響，缺鐵導致的病變有：缺鐵性貧血；缺鐵可誘發糖尿病[4]；缺鐵可導致功能性甲狀腺素低下、溫度調節紊亂、兒茶酚胺代謝改變；缺鐵可引起轉鐵蛋白水平升高，抑制半乳糖腦苷脂的表達，導致神經系統髓鞘化不足，影響腦的發育[5-6]；缺鐵可導致機體淋巴細胞數量下降，影響免疫球蛋白和B細胞免疫球蛋白亞類及其抗體和局部體液免疫功能，使機體免疫能力下降，誘發各種疾病[7]。鐵 過多時，會導致鐵中毒，主要機制是過量的二價鐵離子會誘發Haber-Weiss反應，產生自由基[8]：

鈣是人體不可或缺的一種常量元素，是構成人體骨架的基本成分之一，對人體的生長與發育、疾病與健康、衰老與死亡起著重要作用[9-11]。人體內約99%的鈣分布于骨和牙組織中，成為人體的鈣庫，其余1%則主要存在于人體細胞周圍的細胞間液中。被吸收的鈣可以通過消化道、腎臟、皮膚代謝出體外，也可以通過骨形成機制形成骨骼（圖1）[12]。其生理功能主要體現在以下幾個方面：鈣含量能調節細胞表面的膜電位變化，導致興奮性傳遞的改變；鈣在血小板凝集和止血中起重要作用；鈣-鈣調素結合體能夠參與細胞內鈣調蛋白的調控功能；鈣在細胞內通過第二信使和偶聯作用調節細胞內的多種反應[13]。另外，鈣還參與人體其他生理過程，如降低毛細血管和細胞膜的通透性[14]；維持體內酸堿平衡；鈣與腸道內膽汁酸和脂肪酸結合生成鈣皂，能緩和腸道刺激作用，防止結腸癌的發生；控制新陳代謝、細胞黏附和分裂等[15]。

圖1 鈣在人體內的代謝途徑[[1122]]Fig.1 Schematic diagram of the flow of calcium through the body[[1122]]

一直以來，很多人錯誤地認為鈣這種常量元素廣泛存在，能從食物中得到充足供應而不缺乏，但醫學研究的結果表明這是一種誤解。事實上人體容易缺鈣，缺鈣對人的健康有很大的影響，其中以兒童和老年人最甚。據國務院新聞部發布的第4次中國居民營養與健康現狀調查顯示[16]，由于我國居民有經常喝飲料、咖啡、濃茶等飲食習慣及消費植物性來源食物的原因[17-19]，居民膳食鈣的攝人量較低，只達到我國營養學會推薦供給量標準的一半，有些地區兒童只達到推薦攝入量的20%～50%，因此兒童中佝僂病仍較為常見。在農村，多數人鈣攝入量為400 mg/d，低于推薦攝入量800 mg/d，缺鈣已成為影響我國人民健康的嚴重問題。缺鈣最嚴重的人群包括：嬰幼兒及生長發育期的兒童，若攝入鈣不足，將影響孩子的身高、骨密度、牙密度和肌肉強度，使兒童出現骨痛、牙齒發育不良、生長遲緩，出現佝僂病等癥狀；妊娠、哺乳期的婦女[20-21]，如果鈣補充不足，會導致在懷孕期間出現肌肉痙攣、小腿抽筋、腰酸背痛等鈣缺乏癥狀；老年人，尤其是絕經以后的老年婦女，其機體對鈣的吸收率呈直線下降，骨溶解也相應加速，機體脫鈣加劇，極易發生骨質疏松癥；在特殊環境下工作的人群，如在高真空、強輻射、超重、失重環境下在太空進行空間作業的宇航員[22]，他們在這種特因環境下生理系統會失衡，鈣流失最嚴重，且在返回地面后，生理系統需要一段時間才能恢復，但是骨鈣的丟失卻會持續進行，會嚴重危害航天員生命安全和飛行任務的順利執行。

鋅對于維持體內糖、蛋白質和核酸等生物大分子的體內調控代謝具有重要作用，對視神經也具有重要調節作用，能夠顯著改善視力[23]，除此之外，鋅對于人體免疫系統、生殖功能系統、人體生長發育、腦細胞的成熟分化以及食欲等都有重要影響[24]。鋅的缺乏也會對上述方面產生不良影響。

硒是人和動物所必需的微量元素，具有提高機體免疫力、抗癌、抗自由基、延緩衰老、拮抗有毒元素、防治某些地方性流行病等多種功能，因此硒的補充也是至關重要的[25-26]。此外，還有其他的一些微量礦質元素，人體若缺乏，也會導致各種病變。

然而，目前市場上常見的礦質元素補充制劑以鐵、鈣和鋅的偏多。對于鐵元素來說，主要有如下三代補鐵制劑：

以亞鐵離子的無機鹽為代表的第一代補鐵制劑。這些無機鹽包括：硫酸亞鐵、氯化亞鐵、磷酸鐵鈉、焦磷酸亞鐵、氨基磷酸肽等[27]。由于這些化合物易與硫化物及多酚結合引起食品變色變質，而且服用過多Fe2+會誘發Fenton反應產生自由基，對胃腸道刺激嚴重，甚至會造成疾病的風險[8]；另外，亞鐵離子會受到食物中一些如植酸、單寧等小分子螯合劑的干擾，也可能會與糖、DNA等分子結合，導致亞鐵離子的吸收利用率低下[28-30]。

以非血紅素鐵——乳酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、檸檬酸亞鐵等可溶的有機小分子為代表的第二代補鐵制劑[31]。與第一代補鐵制劑相比，第二代補鐵制劑鐵的吸收利用率普遍提高，但是由于它們會引起胃腸道的不良反應，如惡心、嘔吐等，使得其推廣受到一定的限制。

以乙二胺四乙酸鐵鈉鹽、甘氨酸鐵、蘇氨酸鐵等小分子螯合物為代表的第三代補鐵制劑[1]。這些螯合鐵制劑吸收效率高、性質穩定、口感好，關鍵的是其不會刺激胃腸道，也不會影響食品品質。但由于成本高，目前還難以普及。

而對于鈣來說，市場上鈣制劑品種繁多，主要分為無機鈣、天然生物鈣、有機酸鈣制劑和氨基酸螯合鈣制劑。無機鈣主要指以動物或魚類磷骨、珍珠、貝殼或碳酸鈣礦石等為原料加工而成的無機鈣鹽，如碳酸鈣、碳酸氫鈣、磷酸氫鈣、氧化鈣、磷酸氫鈣和氯化鈣[16]；天然生物鈣也叫活性鈣，是將天然貝殼或珍珠粉經高溫煅燒制成，有的另輔以中藥，除含鈣外，還含有人體所需的磷、鋅、鍶、錳等微量元素，如蓋天力、珍珠鈣膠囊、活性鈣膠囊、益鈣靈、龍牡壯骨沖劑等；有機鈣主要有醋酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、蘇糖酸鈣和葡萄糖酸鈣等；氨基酸螯合鈣主要有蘇氨酸鈣/樂力膠囊等[9]。

鋅的制劑方面，和鈣制劑產品類似，也主要分為無機鋅、有機合成鋅、氨基酸或蛋白質螯合鋅制劑等，主要由無機型、普通有機型發展至蛋白質型、小肽型、氨基酸型，推動了新的補鋅制劑的開發進展。而對于硒來說，當前廣泛使用的補硒方法是在日糧中添加亞硒酸鈉，鑒于其結合率低、毒性大、而且會對環境造成潛在的污染，因此已被限量使用[26]。

綜上所述，當前的礦質元素營養強化劑均存在不同的弊病，如鐵、鈣、鋅等營養強化劑普遍存在水溶性較差、吸收率低、易受膳食中其他因子的影響，如易與檸檬酸、植酸等形成不溶物，影響這些礦質元素營養強化劑的吸收效率[9,26,32]，因此，開發高效、安全的礦質元素營養強化劑勢在必行。

而鐵蛋白作為一種自然界廣泛存在的天然蛋白，具有開發新型礦質元素營養強化劑的潛力。鐵蛋白廣泛存在于動物、植物和細菌體內，由于其具有儲存鐵元素及調節體內鐵平衡的功能，鐵蛋白能夠使機體內的鐵保持可溶、無毒且生物可利用的形式[33]。動物和植物鐵蛋白在結構和功能上有很大的不同。動物鐵蛋白通常包括H和L亞基，而植物鐵蛋白只含有H亞基，但通常由H-1和H-2兩種不同的亞基組成。另外，植物鐵蛋白每個亞基的N端還含有獨特的Extension Peptide（EP）肽段，因此每個鐵蛋白分子24個亞基含有24個EP肽段[34-37]。

同時，由于鐵蛋白中空的特殊結構，越來越多的研究者利用脫鐵鐵蛋白的蛋白質外殼作為載體裝載其它可供利用的金屬離子來制備新型生物納米運載體系[38]。將鐵蛋白內部的鐵核在無氧條件下通過還原反應使Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ）而被去除，最后得到中空的脫鐵鐵蛋白，然后利用各種物理化學方法將其他礦物質離子加入到脫鐵鐵蛋白當中，制備成新型的功能性生物納米顆粒。本篇綜述主要闡明了鐵蛋白在結構及功能方面的研究新進展，其作為礦質元素營養強化劑載體方面的應用以及鐵蛋白在功能性食品方面的應用前景。

圖2 重組大豆鐵蛋白分子結構[[99]]Fig.2 Graphic representations of the SFER4 structure[9]

1 鐵蛋白分子的結構

1.1 鐵蛋白分子的保守結構

鐵蛋白是一個由24個亞基組成的中空球狀分子（圖2），內外直徑分別約為8、12 nm，每分子鐵蛋白空腔內最多可以貯存4 500個鐵原子。從細菌鐵蛋白到植物鐵蛋白再到人體鐵蛋白，其結構都非常保守。鐵蛋白亞基長約5 nm，寬約2.5 nm，外形近似圓柱體，且每個亞基由一個兩兩成反向平行的α螺旋簇（A、B和C、D）和一個較短α螺旋（E）組成，B螺旋和C螺旋之間由一段含18個氨基酸的鏈連接（BC-loop），E螺旋位于α螺旋簇尾端并與之成60°夾角（圖2a）；這24個亞基形成4-3-2重軸對稱，一分子鐵蛋白包括12個2重軸通道（圖2b，黑色的圓所示位置），8個3重軸通道（圖2c，黑色的圓所示位置）和6個4重軸通道（圖2，黑色的圓所示位置），這些通道負責鐵蛋白與外部環境中物質的交換，是鐵離子與氧氣分子以及其他分子或離子進出鐵蛋白的橋梁，起著溝通鐵蛋白內部空腔與外部環境的作用[39]。

其中，3個亞基形成一個3重軸通道，它是鐵離子進入蛋白質的主要途徑。鐵蛋白的3重軸通道高度對稱，這8個孔道是控制還原劑和螯合劑進入鐵蛋白內部空腔的通道。每4個亞基及位于鐵蛋白亞基C端的4個亞基上的E螺旋參4重軸通道的形成，但是到目前為止，鐵蛋白4重軸通道的生物學功能還不清楚，所以鐵蛋白的4重軸通道以及E螺旋的生物學功能還有待進一步研究[2,39]。

1.2 動物鐵蛋白分子的結構

動物鐵蛋白分子是由H（即重鏈，heavy）和L（即輕鏈，light）兩種類型的亞基組成，其分子質量分別約為21 kD和19.5 kD，具有55%的同源性。二者在鐵蛋白中所起的作用是不一樣的，H型亞基具有亞鐵氧化中心[40]，該中心是由Glu27、Tyr34、Glu62、His65、Glu107和Gln141等氨基酸組成的，主要功能是負責Fe（Ⅱ）的快速氧化。每個亞鐵氧化中心可以結合兩個Fe（Ⅱ）離子，并把Fe（Ⅱ）離子快速氧化成Fe（Ⅲ）送入蛋白質空腔內部形成鐵核。而與H型亞基不同，L型亞基沒有亞鐵氧化中心，但有一個假定成核中心。它由Glu53、Glu56和Glu57組成，其在亞鐵的慢速氧化和礦化作用中有重要意義。動物鐵蛋白中兩種亞基總數也為24，但是H/L的比例隨不同的器官而變化，從而滿足各種細胞對鐵的不同需求。例如：富含L型亞基鐵蛋白的器官偏向于貯存鐵的功能，其空腔中的鐵原子含量就較高，代表性的器官有肝和脾；而富含H型亞基鐵蛋白的器官，其每個鐵蛋白分子含有的鐵原子就較少，但卻具有鐵代謝旺盛的特點，代表性的器官是心臟和腦[9,39]。

1.3 植物鐵蛋白分子的結構

與動物鐵蛋白相比，植物鐵蛋白和動物鐵蛋白的起源是相同的，結構基本一樣，但是植物鐵蛋白有一個顯著的不同點，即具有EP肽段。它是成熟的植物鐵蛋白亞基N端特有的重要組成部分，H-1和H-2亞基來源于不同的前體蛋白，前體蛋白的N端包含兩個植物鐵蛋白所特有的結構域-TP（transit peptide）和EP。TP主要負責將前體蛋白轉運到質體中，一旦前體蛋白進入質體，TP就會被切除掉，然后亞基在質體中組裝成成熟的鐵蛋白。早期的研究認為EP與鐵蛋白的穩定性有關，最新的研究表明，EP肽段包含植物鐵蛋白的第二個亞鐵氧化中心，負責Fe2+的表面氧化及促進植物鐵蛋白的聚合[41]，并且具有絲氨酸蛋白酶的活性，會導致鐵蛋白降解并促進鐵的釋放，與降解這一過程相伴隨的是快速的鐵釋放以滿足種子生長的需要，即植物鐵蛋白通過EP來調節鐵釋放從而起到補充鐵的作用[9,35-36,42]。

盡管動物鐵蛋白和植物鐵蛋白的起源相同，但是它們在生物進化的過程中，存在著諸多差異。動物鐵蛋白受控于翻譯水平即mRNA水平調控，而植物鐵蛋白受調控于轉錄水平即DNA水平；前者存在于細胞質中[9,39]，而后者存在于細胞質體中；從鐵蛋白存在的環境來看，前者周圍的磷酸根濃度低，約1 mmol/L，而后者周圍的磷酸根濃度高，約12 mmol/L；從亞基的組成上來看，前者同時含有H型和L型，而后者只含有H型亞基，且到目前為止，發現的植物鐵蛋白亞基均由H-1和H-2兩種亞基組成，亞基大小分別為26.5 kD和28.0 kD[41]。同時也克隆得到了大豆鐵蛋白H-1和H-2亞基的編碼基因分別為SferH-1和SferH-2，充分證實植物鐵蛋白是多基因編碼的。同樣的例子還有黑豆、蠶豆、玉米、苜蓿以及擬南芥等植物種子中分離得到的鐵蛋白都是由這兩種H型亞基組成[35,43]。

2 鐵蛋白的功能

鐵蛋白在生物體內具有兩種主要功能：一是維持生物體內鐵的代謝平衡。鐵蛋白是普遍存在于生物體內的一種儲存鐵的蛋白質，其儲存鐵的過程主要包括Fe（Ⅱ）的氧化、Fe（Ⅲ）的轉移、礦質鐵核的形成和生長，從而能夠將鐵貯存在鐵蛋白內部；二是能夠通過清除鐵介導的自由基而抑制Fenton反應，防止過量鐵導致的氧化性脅迫。這是由于二價鐵能活化過氧化氫，形成羥自由基，后者具有很強的氧化能力，能損傷細胞，導致細胞完整性的喪失，甚至引起細胞死亡。而鐵蛋白通過截獲細胞間的鐵，從而阻止鐵參與Fenton反應產生的羥自由基，而保護細胞免受因各種環境脅迫而導致的細胞氧化性損傷[44]。

2.1 鐵蛋白的3條鐵吸收途徑

鐵蛋白貯存鐵的過程，又被成為鐵吸收或者鐵氧化沉淀過程。而鐵蛋白鐵吸收反應具體是指當細胞內Fe（Ⅱ）濃度高時，在氧化劑（氧分子或過氧化氫）存在的情況下Fe（Ⅱ）被鐵蛋白催化氧化，并把生成的Fe（Ⅲ）儲藏于其內部空腔的過程。理論上，每分子鐵蛋白最多可儲存4 500個Fe（Ⅲ）。關于Fe（Ⅱ）在鐵蛋白中的氧化沉淀機理也成為國際生物無機化學領域的研究熱點[45]。研究主要集中于重組的人重鏈鐵蛋白、馬脾鐵蛋白、重組的牛蛙M鐵蛋白。對以上鐵蛋白鐵氧化沉淀機理的研究發現了如下3條途徑[35,46]。

第一條途徑：當加入Fe（Ⅱ）的量≤2 Fe（Ⅱ）/H-chain時，反應機理如下：

P代表未結合鐵的亞鐵氧化中心，它位于H型亞基中。從方程式（4）可以看出，反應形成了三價雙鐵中間體，該中間體在可見區650 nm左右有最大吸收，該化合物不穩定，迅速分解為氧橋連的三價雙鐵配合物；并最終分解為單核的Fe（Ⅲ）化合物，從亞鐵氧化中心轉移至鐵蛋白空腔內，形成礦化核FeOOH(core)。

第二條途徑：當加入Fe（Ⅱ）的量＞10 Fe(Ⅱ)/H-chain時，鐵的氧化主要在鐵核上進行，這時礦化機理扮演主要角色，反應方程式如下：

Zhao Guanghua等[47-48]利用停流技術并結合紫外光譜手段對人重鏈鐵蛋白的研究表明：當一次加入的Fe（Ⅱ）的量＞48 Fe（Ⅱ）/鐵蛋白時，過氧橋連的三價雙鐵中間體也可形成，但隨著一次性加入的鐵量從100增加到800 Fe（Ⅱ）/鐵蛋白時，過氧橋連的三價雙鐵中間體在650 nm呈現出非凡的生成和分解動力學曲線。當加入Fe（Ⅱ）的量多時，蛋白催化與礦化機理同時并存，但是隨著加入量的逐漸增加，礦化機理所作用所占比重增大。

第三條途徑：當加入Fe（Ⅱ）的量多時，除了上述這兩條鐵氧化途徑外還存在另一個去毒反應[46]，即鐵氧化沉淀的第3條途徑，如反應方程式（6）所示：

從反應方程式（6）可以看出，雖然它的反應物與Fenton反應相同，但產物卻大不相同，沒有羥自由基的產生，因此，通過這個反應，鐵蛋白不但可以去除Fe（Ⅱ）的毒性，同時還可以消除過氧化氫的毒性，更加證實了鐵蛋白在細胞內具有去毒功能。有報道利用EPR順磁旋誘捕技術在無氧條件下監測Fe（Ⅱ）與過氧化氫反應有無羥自由基的生成，發現當人重組H型亞基鐵蛋白存在時，羥自由基生成得到極大抑制，即人重組H型亞基鐵蛋白可以抑制Fenton反應的發生，而且這項功能與亞鐵氧化中心密切相關[9,49]，上述結果與鐵蛋白的去毒功能是一致的。

2.2 植物鐵蛋白新的鐵吸收途徑

Li Chaorui等[41]近期發現在植物鐵蛋白中存在一條新的鐵吸收途徑——表面氧化途徑。植物鐵蛋白與動物鐵蛋白最大的區別在于前者的N端上存在EP肽段，它存在于鐵蛋白的表面，而動物鐵蛋白不具有此肽段[39]。研究發現在植物鐵蛋白中，當加入Fe（Ⅱ）過量情況下，鐵蛋白空腔內鐵礦核較小（＜200 Fe/shell）時，除了上述這3條鐵氧化途徑外還存在第4條途徑，即植物鐵蛋白的表面氧化途徑，見圖3。

圖3 豌豆鐵蛋白亞鐵離子表面氧化過程示意圖（≥48 Fe（Ⅱ）時發生）[[4411]]Fig.3 A proposed pathway of Fe(II) oxidative deposition in PSF through protein association at high Fe(Ⅱ) flux (more than 48 Fe(Ⅱ)/protein) [[4411]]

如圖3所示，植物鐵蛋白表面氧化途徑的步驟是：首先是結合反應，即當Fe（Ⅱ）過量情況下（＞2 Fe(Ⅱ)/H-chain），鐵蛋白空腔內鐵礦核較小（＜200 Fe(Ⅲ)/H-chain）時，Fe（Ⅱ）結合到位于植物鐵蛋白N-末端的EP肽段上；其次是氧化反應，Fe（Ⅱ）被氧化為Fe（Ⅲ）（即Species A）；再次是聚合反應，Fe（Ⅲ）單體聚合形成中間體B和C，再到形成終產物D；最后是解聚反應，即Fe（Ⅲ）轉移至植物鐵蛋白空腔內部，終產物D解聚，然后EP再重復下一個同樣的過程[41]。這被認為是鐵蛋白的第4條氧化途徑，這與植物鐵蛋白的特殊結構有關。

2.3 鐵蛋白的鐵釋放途徑

鐵釋放是指儲存于鐵蛋白內部空腔內的Fe（Ⅲ）被還原為Fe（Ⅱ），并轉移到鐵蛋白外部供機體利用的過程稱為鐵蛋白的鐵釋放或者叫鐵還原。目前，對于鐵蛋白的鐵吸收途徑研究比較清楚，由于研究手段的限制及鐵蛋白釋放的復雜性等原因，對于鐵釋放途徑相關的研究還比較少。然而，鐵蛋白的鐵還原釋放具有重大的意義，該過程與動植物細胞的生長、發育中鐵元素的供給有著密切的關系。在動物體內鐵蛋白還原釋放鐵供機體利用的研究還很少，但是在大豆中發現其鐵蛋白的EP具有絲氨酸蛋白酶活性，可以導致自身降解[36,50-52]，與之相伴的是鐵的快速釋放來滿足機體發育的需求，這代表一種新的鐵釋放供機體利用的途徑。

3 鐵蛋白作為礦質元素營養強化劑載體的研究進展

鐵蛋白除了上述體內的生物學功能以外，越來越多的研究表明，鐵蛋白具有第3個新的功能，其特殊的中空結構和籠形的蛋白質外殼具備作為開發為天然、形態均一的礦質元素營養強化劑的載體，通過鐵蛋白作為載體的生物納米運載體系，可以克服金屬離子溶解度低、易受胃腸道環境影響的缺點，從而大大提高礦質元素的生物利用率。到目前為止，應用脫鐵鐵蛋白作為納米載體的研究主要集中在運載金屬離子和有機小分子方面，在脫鐵鐵蛋白內部儲存礦質元素的方法主要有如下幾種。

3.1 礦化成核儲存礦質元素

鐵蛋白內部空腔表面因具有大量酸性氨基酸殘基而帶負電，所以利用這一特點，鐵蛋白殼內部形成金屬氧化物或氫氧化物的礦化核（圖4）[53]。已報道的金屬鹽離子礦化核主要有：Co(O)OH、Co3O4[54]、CdS[55]、CdSe[56]、Cr(OH)、Ni(OH)[57]、Mn(O)OH、MnO[58-59]、3334In2O3[60]、FeS[61]、ZnSe[62]、CuS[63]等。這些金屬納米顆粒可以用于單電子晶體管和浮閘內存[38]。金屬核的形成過程分為兩種。一種是Zn、Fe、Ca等金屬離子，采用脫鐵鐵蛋白與金屬鹽溶液在一定的pH值和溫度條件下發生反應，可在鐵蛋白內部形成對應的金屬氧化物的礦化核，透射電鏡顯示在鐵蛋白內部形成的金屬礦化核大小為約為8 nm[64]，因為鐵蛋白上有這些金屬離子的結合位點或者氧化還原位點。另一種如CdS、ZnSe等，由于鐵蛋白上沒有這些金屬離子的結合位點，要在其內部形成礦化核需要采用一些其他方法，利用一種緩慢釋放體系，使得在外界環境中結合形成復合物的兩種組分，在馬脾鐵蛋白內腔中形成復合物以形成金屬核。以CdS的制備為例，在充入氮氣的無氧環境中，向脫鐵馬脾鐵蛋白中加入Cd2+，反應1 h后加入HS－，再反應45 min后，繼續加入HS－，反應1 h，最后用緩沖液透析除去游離的Cd2+或HS－。重復此過程，使CdS顆粒在脫鐵的馬脾鐵蛋白的空腔內成長[9,65]。

圖4 脫鐵鐵蛋白內儲存礦質元素的過程[[5533]]Fig.4 Synthetic pathways that are possible using ferritin as a constrained reaction environment[53]

3.2 肽段序列修飾或基因改造鐵蛋白儲存金屬元素

通過這個方法使鐵蛋白的蛋白殼具備結合金屬離子的能力，從而在鐵蛋白內部成核。以Ag[66]為例，鐵蛋白自身的氨基酸序列及其三維結構中沒有Ag的結合位點，利用常規方法難以制備含Ag的鐵蛋白納米顆粒。但是通過在鐵蛋白亞基C末端的氨基酸序列上添加可以結合Ag+的小肽，不但不影響鐵蛋白的自身組裝，而且還能增加修飾后的鐵蛋白對Ag+的親和力。使得Ag+更容易結合在鐵蛋白的內表面，此時再通過氧化還原手段將Ag+還原成Ag，使其在鐵蛋白內部形成Ag金屬，達到制備含Ag的蛋白納米顆粒。

3.3 還原成金屬單質沉積儲存金屬元素

主要是通過擴散的方式使金屬陽離子擴散進入鐵蛋白內部空腔，再利用還原劑將其還原成金屬單質，從而在脫鐵鐵蛋白內部沉積。采用這種方法在鐵蛋白內部形成的金屬核主要有：Cu[67]、Pd[68]等。例如Gálvez等[67]在脫鐵馬脾鐵蛋白內部合成金屬Cu：反應體系在4℃條件下進行，pH值穩定在8.0左右，向馬脾鐵蛋白溶液中加入CuSO4溶液，使得Cu與馬脾鐵蛋白的物質的量比為2 000。二者形成的復合物通過分子篩層析色譜柱分離純化后，向溶液中加入還原劑NaBH4，反應24 h，將鐵蛋白內的Cu2+還原為銅單質。

4 鐵蛋白作為礦質元素營養強化劑載體在體內的吸收途徑

天然存在于動植物體內的鐵蛋白由于其豐富的鐵元素，因此可以作為良好的鐵營養補充劑，最近的研究表明，目前鐵蛋白中的鐵元素在體內的吸收途徑存在如下3種情況（圖5）[69]：第1種情況是鐵蛋白的蛋白質外殼在胃腸道中因胃酸及胃蛋白酶的水解作用，導致蛋白殼降解破壞，釋放出的鐵核被還原劑（如VC）還原成Fe2+，Fe2+被二價金屬受體（DMT1）轉運到小腸上皮細胞中，此途徑是已被廣泛認可；第2種情況是攜帶鐵核的鐵蛋白在胃里仍然完全被酶降解，鐵核作為一個整體釋放出來，達到小腸后，可能存在鐵核的轉運載體，直接將鐵核進行吸收，此途徑僅是一種假設，尚待驗證；第3種情況是鐵蛋白在胃里未完全降解，仍有部分完整外殼的鐵蛋白，它們達到小腸后，經鐵蛋白的專一受體而被吸收，鐵核由于在其內部就一道被機體吸收，這個機制已越來越被大家廣泛認同。Zhang Tuo等[70]的最新研究表明，裝載有花青素的植物鐵蛋白能夠直接被小腸上的Caco-2細胞吸收，并且提高了花青素的穩定性和吸收量；Li Meiliang等[64]的最新研究也表明，裝載有鈣核的紅小豆植物鐵蛋白能夠通過轉鐵蛋白受體（TfR1）被Caco-2細胞吸收，而且該途徑鈣的吸收率明顯高于Caco-2細胞對游離鈣離子的吸收。

圖5 鐵蛋白中的鐵可能的吸收機制[[6699]]Fig.5 Possible mechanisms for iron uptake from ferritin[69]

鐵蛋白不僅可以儲存鐵、鈣、鋅等礦質營養元素，還可以儲存一些有機小分子物質[70-71]，如Chen Lingli等[71]的最新研究表明，將β-胡蘿卜素裝載進入鐵蛋白后，可以顯著提高其水溶性和熱穩定性。因此鐵蛋白作為一個可食生物納米載體是完全可行，其作為載體開發礦質元素營養強化劑具有現實可行性。

5 結 語

鐵蛋白獨特的籠形結構，使得其作為礦質元素營養強化劑的載體具有廣闊的應用前景，鐵、鈣、鋅等已被成功地裝載到其內部空腔已得到驗證，同時它也可以作為各種維生素的良好載體，利用其作為載體開發各種類型的營養強化劑。由于鐵蛋白本身具有較好的水溶性，且將礦質元素包裹在內部空腔，因此它可以克服金屬離子溶解度低、易受體系外環境或物質干擾的缺點，進而大大提高生物利用率；鐵蛋白在小腸上皮細胞中具有其特有的吸收載體能被完整吸收，免受膳食因子的影響，存在于其內部空腔的營養強化劑即可不受干擾直接進入而被吸收，從而大大提高生物利用率；由于鐵蛋白也是來自于可食的動植物中，其本身富含人體所需的多種必需氨基酸，具有豐富的營養，同時對礦質元素的吸收也可以起到輔助作用，因此，鐵蛋白在食品領域具有廣闊的應用前景。

[1]鄧建軍.大豆鐵蛋白鐵吸收和釋放機理及其體外抗蛋白酶降解研究[D].北京: 中國農業大學, 2010.

[2]CHASTEEN N D, HARRISON P M.Mineralization in ferritin: an efficient means of iron storage[J].Journal of Structural Biology, 1999,126(3): 182-194.

[3]付曉蘋.大豆鐵蛋白的自降解機理及其生理學功能研究[D].北京:中國農業大學, 2010.

[4]陳璐璐.微量元素與糖尿病[J].中國臨床營養雜志, 2002, 10(3):220-224.

[5]徐靜.質子激發X線發射法分析精神異常兒童血液中的微量元素[J].國外醫學地理分冊, 2003, 24(2): 74-75.

[6]劉中國, 王艷燕.兒童貧血與學習能力關系的研究[J].山西醫科大學學報, 2001, 32(1): 22-23.

[7]林曉明, 龍珠.維生素A與鐵缺乏對小鼠免疫功能的影響[J].營養學報, 2001, 23(1): 36-38.

[8]GRADY J K, CHEN Y, CHASTEEN N D, et al.Hydroxyl radical production during oxidative deposition of iron in ferritin[J].Journal of Biological Chemistry, 1989, 264: 20224-20229.

[9]李美良.單亞基植物鐵蛋白的制備、性質及鐵蛋白鈣復合物吸收特性研究[D].北京: 中國農業大學, 2013.

[10]NORDIN B E C.Calcium, phosphate and magnesium metabolism[M].Edinburgh: Churchill Livingston, 1976.

[11]BROWN E M.Extracellular Ca2+sensing, regulation of parathyroid cell function, and role of Ca2+and other ions as extracellular (first)messengers[J].Physiological Reviews.1991, 71(2): 371-411.

[12]BRONNER F, PANSU D.Nutritional aspects of calcium absorption[J].Journal of Nutrition, 1999, 129(1): 9-12.

[13]FULLER K E, CASPARIAN J M.Vitamin D: balancing cutaneous and systemic considerations[J].Southern Medical Journal, 2001, 94(1): 58-64.

[14]WALKER-BONE K, DENNISON E, COOPER C.Epidemiology of osteoporosis[J].Rheumatic Disease Clinics of North America, 2001,27(1): 1-18.

[15]SCHMIDT H H, LOHMANN S M, WALTER U.The nitricoxide and cGMP signal transduction system: regulation and mechanism of action[J].Biochimica et Biophysica Acta, 1993, 1178(2): 153-175.

[16]劉洪玲, 劉建軍, 趙祥穎.果酸鈣的研究現狀及展望[J].中國食品添加劑, 2007(1): 105-113.

[17]HEANEY R P, WEAVER C M, RECKER R R.Calcium absorbability from spinach[J].Journal of the American College of Nutrition, 1988,47: 707-709.

[18]PANKAJA N, PRAKASH J.Availability of calcium from kilkeerai(Amaranthus tricolor) and drumstick (Moringa oleifera) greens in weanling rats[J].Nahrung, 1994, 38: 199-203.

[19]LI Meiliang, JIA Xiaoling, YANG Jingyun, et al.Effect of tannic acid on properties of soybean (Glycine max) seed ferritin: a model for interaction between naturally-occurring components in foodstuffs[J].Food Chemistry, 2012, 133: 410-415.

[20]劉紹軍, 劉麗娜.孕婦妊娠期缺鈣的原因及對策探討[J].中國醫藥科學, 2011, 10(1): 53-54.

[21]王英, 胡素蘭.娠期補鈣補鐵預防妊娠高血壓疾病發生的臨床分析[J].中國保健營養, 2012(4): 1-3.

[22]陸麗燕, 何明, 王偉, 等.41Ca-AMS-生物示蹤的有力工具[J].生命科學, 2010, 22(2): 197-201.

[23]DEBJIT B, CHIRANJIB K P, SAMPATH K.A potential medicinal importance of zinc in human health and chronic disease[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 1: 5-11.

[24]楊曉偉.牡蠣中鋅高結合量肌動蛋白的制備及其與Zn2+相互作用研究[D].北京: 中國農業大學, 2013.

[25]杜明, 趙鐳, 李朝睿, 等.富硒靈芝中一種新含硒蛋白的純化、性質及其自由基清除活性研究[J].高等化學學報, 2007, 28(1): 75-78.

[26]楊家軍.富硒益生菌制劑工業化生產條件及其抑制致病性大腸桿菌的研究[D].南京: 南京農業大學, 2008.

[27]周章張, 趙國華, 周才瓊, 等.鐵強化劑的研究應用現狀[J].中國食品添加劑, 2005(1): 95-98.

[28]HALLBERG L.Bioavailability of dietary iron in man[J].Annual Review of Nutrition, 1981, 1: 123-147.

[29]YANG Rui, YANG Senpei, LIAO Xiayun, et al.The interaction of DNA with phytoferritin during iron oxidation[J].Food Chemistry,2014, 153: 292-297.

[30]LIAO Xiayun, Lü Chenyan, ZHANG Xiuqing, et al.A novel strategy of natural plant ferritin to protect DNA from oxidative damage during iron oxidation[J].Free Radical Biology and Medicine, 2012, 53(2):375-382.

[31]劉婭, 韓新年.天然補鐵劑: 血紅素鐵的研究進展[J].中國食品添加劑, 2005(4): 5-8.

[32]YANG Senpei, BAI Guangling, CHEN Lingli, et al.The interaction of phenolic acids with Fe(III) in the presence of citrate as studied by isothermal titration calorimetry[J].Food Chemistry, 2014, 157: 302-309.

[33]MASUDA T, GOTO F, YOSHIHARA T, et al.Crystal structure of plant ferritin reveals a novel metal binding site that functions as a transit site for metal transfer in ferritin[J].The Journal of Biological Chemistry, 2010, 285: 4049-4059.

[34]趙廣華, 云少君.植物鐵蛋白結構、性質及其在納米材料制備中的應用[J].山西大學學報, 2012, 35(2): 285-292.

[35]ZHAO Guanghua.Phytoferritin and its implications for human health and nutrition[J].Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1800(8): 815-823.

[36]FU Xiaoping, DENG Jianjun, YANG Haixia, et al.A novel EP-involved pathway for iron release from soybean seed ferritin[J].Biochemical Journal, 2010, 427: 313-321.

[37]陳盈盈, 黃琳, 季雪濤, 等.用圓二色性和熒光光譜技術研究納米吡啰紅G核-鐵蛋白的構建機理[J].高等化學學報, 2010, 13(5): 896-904.

[38]YAMASHITA I, IWAHORI K, KUMAGAI S, et al.Ferritin in the field of nanodevices[J].Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1800(8):846-857.

[39]HARRISON P M, AROSIO P.Ferritins: Molecular properties, iron storage function and cellular regulation[J].Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1275: 161-203.

[40]BOU-ABDALLAH F, ZHAO Guanghua, BIASIOTTO G.Facilitated diffusion of iron(II) and dioxygen substrates into human H-chain ferritin.A fluorescence and absorbance study employing the ferroxidase center substitution Y34W[J].Journal of the American Chemical Society, 2008, 130: 17801-17811.

[41]LI Chaorui, FU Xiaoping, QI Xin, et al.Protein association and disassociation regulated by ferric ion.A novel pathway for oxidative deposition of iron in pea seed ferritin[J].The Journal of Biological Chemistry, 2009, 284: 16743-16751.

[42]LI Meiliang, YUN Shaojun, YANG Xiuli, et al.Stability and iron oxidation properties of a novel homopolymeric plant ferritin from adzuki bean seeds: a comparative analysis with recombinant soybean seed H-1 chain ferritin[J].Biochimica et Biophysica Acta, 2013, 1830:2946-2953.

[43]YUN Shaojun, YANG Senpei, HUANG Luyao, et al.Isolation and characterization of a new phytoferritin fro m broad bean (Vicia faba)seed with higher stability compared to pea seed ferritin[J].Food Research International, 2012, 48: 271-276.

[44]RAVET K, TOURAINE B, BOUCHEREZ J, et al.Ferritins control interaction between iron homeostasis and oxidative stress in Arabidopsis[J].The Plant Journal, 2009, 57: 400-412.

[45]胡菊, 廖夏云, 鄧建軍, 等.黃豆鐵蛋白提取新方法及其與豌豆鐵蛋白活性比較[J].高等學校化學學報, 2009, 30(10): 2003-2008.

[46]ZHAO Guanghua, BOU-ABDALLAH F, AROSIO P, et al.Multiple pathways for mineral core formation in mammalian apoferritin: the role of hydrogen peroxide[J].Biochemistry, 2003, 42: 3142-3150.

[47]ZHAO Guanghua, SU Meihong, CHASTEEN N D.μ-1,2-Peroxo diferric complex formation in horse spleen ferritin: a mixed H/L-subunit heteropolymer[J].Journal of Molecular Biology, 2005, 352: 467-477.

[48]BOU-ABDALLAH F, ZHAO Guanghua, MAYNE H R, et al.Origin of the unusual kinetics of iron deposition in human H-chain ferritin[J].Journal of the American Chemical Society, 2005, 127: 3885-3893.

[49]ZHAO Guanghua, AROSIO P, CHASTEEN N D.Iron(II) and hydrogen peroxide detoxification by human H-chain ferritin.An EPR spin-trapping study[J].Biochemistry, 2006, 45: 3429-3436.

[50]ZHANG Tuo, LIAO Xiayun, YANG Rui, et al.Different effects of iron uptake and release by phytoferritin on starch granules[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61: 8215-8223.

[51]Lü Chenyan, BAI Yufei, YANG Senpei, et al.NADH induces iron release from pea seed ferritin: a model for interaction between coenzyme and protein components in foodstuffs[J].Food Chemistry,2013, 141(4): 3851-3858.

[52]DENG Jianjun, LI Meiliang, ZHANG Tuo, et al.Binding of proanthocyanidins to soybean (Glycine max) seed ferritin inhibiting protein degradation by protease in vitro[J].Food Research International, 2011, 44(1): 33-38.

[53]KLEM M T, YOUNG M, DOUGLAS T.Biomimetic magnetic nanoparticles[J].Materials Today, 2005, 8: 28-37.

[54]DOUGLAS T, STARK V T.Nanophase cobalt oxyhydroxide mineral synthesized within the protein cage of ferritin[J].Inorganic chemistry,2000, 39: 1828-1830.

[55]WONG K K W, MANN S.Biomimetic synthesis of cadmium sulfideferritin nanocomposites[J].Advanced Materials, 2004, 8: 928-932.

[56]YAMASHITA I, HAYASHI J, HARA M.Bio-template synthesis of uniform CdSe nanoparticles using cage-shaped protein, apoferritin[J].Chemistry Letters, 2004, 33: 1158-1159.

[57]OKUDA M, IWAHORI K, YAMASHITA I, et al.Fabrication of nickel and chromium nanoparticles using the protein cage of apoferritin[J].Biotechnology and Bioengineering, 2003, 84: 187-194.

[58]MACKLE P, CHARNOCK J M, GARNER C D, et al.Characterization of the manganese core of reconstituted ferritin by X-ray absorption spectroscopy[J].Journal of the American Chemical Society, 1993,115: 8471-8472.

[59]MELDRUM F C, DOUGLAS T, LEVI S, et al.Reconstitution of manganese oxide cores in horse spleen and recombinant ferritins[J].Journal of Inorganic Biochemistry, 1995, 58: 59-68.

[60]OKUDA M, KOBAYASHI Y, SUZUKI K, et al.Self-organized inorganic nanoparticle arrays on protein lattices[J].Nano Letters,2005, 5: 991-993.

[61]DOUGLAS T, DICKSON D, BETTERIDGE S, et al.Synthesis and structure of an iron (iii) sulfide-ferritin bioinorganic nanocomposite[J].Science, 1995, 269: 54-57.

[62]IWAHORI K, YOSHIZAWA K, MURAOKA M, et al.Fabrication of ZnSe nanoparticles in the apoferritin cavity by designing a slow chemical reaction system[J].Inorganic Chemistry, 2005, 44: 6393-6400.

[63]IWAHORI K, TAKAGI R, KISHIMOTO N, et al.A size controlled synthesis of CuS nano-particles in the protein cage, apoferritin[J].Materials Letters, 2011, 65: 3245-3247.

[64]LI Meiliang, ZHANG Tuo, YANG Haixia, et al.A novel calcium supplement prepared by phytoferritin nanocages protects against absorption inhibitors through a unique pathway[J].Bone, 2014, 64:115-123.

[65]WONG K K W, DOUGLAS T, GIDER S, et al.Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin)[J].Chemistry of Materials, 1998, 10: 279-285.

[66]KRAMER R M, LI C, CARTER D C, et al.Engineered protein cages for nanomaterial synthesis[J].Journal of the American Chemical Society, 2004, 126: 13282-13286.

[67]GáLVEZ N, FERNANDEZ B, VALERO E, et al.Apoferritin as a nanoreactor for preparing metallic nanoparticles[J].Comptes Rendus Chimie, 2008, 11: 1207-1212.

[68]UENO T, SUZUKI M, GOTO T, et al.Size-selective olefin hydrogenation by a pd nanocluster provided in an apo-ferritin cage[J].Angewandte Chemie, 2004, 116: 2581-2584.

[69]L?NNERDAL B.Soybean ferritin: implications for iron status of vegetarians[J].The American Journal of Clinical Nutrition, 2009, 89:1680S-1685S.

[70]ZHANG Tuo, Lü Chenyan, CHEN Lingli, et al.Encapsulation of anthocyanin molecules within a ferritin nanocage increases their stability and cell uptake efficiency[J].Food Research International,2014, 62: 183-192.

[71]CHEN Lingli, BAI Guangling, YANG Rui, et al.Encapsulation of β-carotene within ferritin nanocages greatly increases its water-solubility and thermal stability[J].Food Chemistry, 2014, 149: 307-312.