三孢布拉氏霉發酵產β-胡蘿卜素的研究進展

尹金鳳，王志軒，吳欣森，李泓全，徐大剛*，童海寶，董宏偉*

（上?；ぱ芯吭?，上海 200062）

β-胡蘿卜素是生物體內合成VA的前體物質，為許多具有鮮亮顏色的動、植物組織中的主要色素成分。迄今為止，它是類胡蘿卜素家族中研究最為充分的一種四萜化合物。經研究發現，該化合物有抗氧化、促進動物組織發育、提高免疫力以及抗癌等多種生物活性[1]。近年來，由于β-胡蘿卜素的生物功能日益明晰，有關β-胡蘿卜素的相關研究也備受重視。

目前，β-胡蘿卜素的主要生產方法有化學合成法、植物提取法、鹽藻萃取法和生物合成法。其中化學合成法生產成本低廉，但由于產品存在有害物質殘留問題，因此成為限制其應用的瓶頸。植物提取法是最早發現β-胡蘿卜素的方法，也是早期獲取天然β-胡蘿卜素的重要手段[2]。有文獻報道[3]，目前已研究培育出β-胡蘿卜素含量比較高的胡蘿卜新品系，可以為天然β-胡蘿卜素的生產提供優質原料。但由于胡蘿卜生產容易受到地理、氣候、時間和空間的限制，因此很難實現廉價β-胡蘿卜素的大規模工業制備。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）培養是獲取天然β-胡蘿卜素的另一重要來源[2]。但由于鹽藻培養需要強烈的光照和高濃度的鹽分，因此對生產的氣候條件和地理環境提出了極高的要求；另外，該生產過程通常為開放式培養，因此生產過程控制困難，產品品質難以保障。微生物發酵生產天然β-胡蘿卜素由于不受光照、氣候、產地等環境條件的限制，加之產品具有經濟、安全和著色力強等優勢，因此該技術受到國內外市場的廣泛青睞。

三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）具有生長迅速、生物量大、單位菌體β-胡蘿卜素產量高等明顯優勢，是生產天然β-胡蘿卜素的理想菌株，在東歐早已應用于工業化生產[4]。該霉菌屬于接合菌綱、毛霉目、笄霉科、布拉氏霉菌屬，有正負兩種菌株，能產生發達的菌絲，為長管單細胞低等真菌。正負菌單獨培養時，表現為菌絲的延長和分支，細胞核的裂殖增多，以及細胞質的增加。在此過程中，兩種菌株只能合成少量的類胡蘿卜素，并無性繁殖生成孢子囊和孢囊孢子[5-6]。除此之外，正負菌株也可異宗結合，并通過有性繁殖形成接合孢子[7-8]。有研究表明，接合孢子的形成與β-胡蘿卜素合成有密切關系。在正負菌混合發酵過程中，性激素類物質——三孢酸（也曾命名為β因子）的大量生成，對三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素起到重要的促進作用[9]。

基于三孢布拉氏霉菌的生理、結構和代謝特點，在其誘變選育與β-胡蘿卜素發酵的研究中逐漸形成了較為獨特的技術體系。本文從菌種選育及發酵工藝優化等角度，對三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素技術的研究進展進行了概述，并對其研究趨勢和發展方向進行了展望。

1 1 β-胡蘿卜素高產菌株的選育

三孢布拉氏霉菌為典型低等真菌的細胞結構，即無隔膜的絲狀真菌[10]。為了方便誘變及后續處理操作，通常以三孢布拉氏霉孢子作為處理對象，并利用各種化學和物理手段對正負菌孢子分別進行誘變處理。為實現菌種選育工作的高效實施，逐漸根據三孢布拉氏霉菌的生理和代謝特點，形成了獨具特色的誘變和篩選技術體系，也為進一步建立三孢布拉氏霉菌高通量育種技術體系奠定了基礎。

1.1 三孢布拉氏霉菌分離篩選技術的研究進展

三孢布拉氏霉菌孢子涂布于PDA固體培養基表面后，孢子會萌發長出菌絲體并不斷的延伸以及分枝，無法形成規則且界限清晰可辨的圓形菌落。以大小為9 cm的常規篩選平板為例，當平板上的菌落數量超過10個以上時，三孢布拉氏霉極易因菌絲體的蔓延而導致菌落間的相互交叉，從而無法保證菌株分離純化的效果。

有關三孢布拉氏霉菌落分離純化技術的研究，最早見于1977年。Kharabrova等[11]首次通過應用麥芽汁瓊脂雙層平板，從而使得三孢布拉氏霉菌在固體培養基的生長方式，從連續性菌絲蔓延生長轉變為菌落型聚集生長。在一定程度上，該方法有效地解決了三孢布拉氏霉菌落分離純化的技術問題。在改善工作效果和提高工作效率的同時，也有效降低了實驗操作人員的工作量。

另據文獻報道[12-13]，脫氧膽酸鈉作為一種離子型表面活性劑，可以通過改變菌體細胞膜的通透性而發揮抑制真菌菌絲體生長的作用。在三孢布拉氏霉菌落的篩選過程中，脫氧膽酸鈉可使菌體在固體培養基表面形成較為規整和界限清晰的圓形菌落。早在1995年的1 項國際專利中，Finkelstein等[14]就開始將該技術應用于三孢布拉氏霉誘變后孢子的篩選操作。在國內，劉海麗等[12]在固體篩選培養基添加聚乙二醇辛基苯基醚（乳化劑OP）或脫氧膽酸鈉，并對兩種抑制劑的應用效果進行了比較。結果發現，乳化劑OP對三孢布拉氏霉菌體生長的抑制效果較為強烈（最適劑量0.5 g/L），脫氧膽酸鈉對菌體細胞的抑制作用相對較?。ㄗ钸m劑量0.75 g/L）。具體表現為：脫氧膽酸鈉固體培養基表面的氣生菌絲數量與菌落數量略高于含有乳化劑OP的篩選平板[12]。

1.2 高產β-胡蘿卜素菌誘變技術的研究進展

誘變技術，即通過各類物理、化學和輻照等手段，而引起物種的遺傳變異[15]。基于三孢布拉氏霉自身的生理和代謝特點，長期誘變選育工作中積累的研究經驗又反饋于誘變方案的設計，并發展出具有針對性的誘變技術。

1.2.1 化學誘變技術及其在三孢布拉氏霉菌組合誘變中的應用

化學誘變技術是一種簡便易行廣泛應用的生物物種誘變技術。在1995年的國際專利中，Finkelstein等[14]就建議可以利用1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG）、甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）、亞硝酸，核苷酸類似物，吖啶類化合物（acridines）等多種化學誘變劑，并可結合紫外線（UV）、X射線、γ射線等誘變技術，對三孢布拉氏霉菌進行遺傳選育。在其具體實施中，主要采用以EMS、UV，尤其是50～500 μg/mL的NTG對三孢布拉氏霉菌負菌株（ATCC 14272）進行反復多輪誘變篩選，并最終使得β-胡蘿卜素的發酵水平由2.7 g/L最高提至7.0 g/L。

此外，Mehta等[6,16]以NTG對三孢布拉氏霉正負菌孢子（正菌F986和負菌F921）進行處理，并獲得高產突變菌株（正菌SB39、負菌SB32）。通過采用正負菌混合培養，突變株菌絲體β-胡蘿卜素含量（（28.2±5.8）mg/g菌體干質量）相對初始正負菌株（（4.3±1.1）mg/g菌體干質量）提高了約6倍。Perez等[17]則采用UV、EMS、亞硝酸和NTG對三孢布拉氏霉菌孢子（正菌VKPM F-117、負菌VKPM F-208）進行多次誘變，得到正負高產菌株（正菌CPA1、負菌CMA3和CMB2）。通過配對發酵，正菌CPA1與負菌CMA3配對發酵產量為7.2 g/L，正菌CPA1與負菌CMB2配對的發酵產量為6.8 g/L；隨后通過發酵工藝優化，β-胡蘿卜素發酵水平最高達到9.0 g/L。在國內，任雙喜等[18]采用UV、NTG和離子束對三孢布拉氏霉菌負菌N-1孢子進行綜合誘變處理處理，獲得三孢布拉氏霉菌優良負菌株（SCB201）。通過與正菌（SCB200）進行配對發酵實驗，誘變高產菌株的β-胡蘿卜素發酵水平達到2.0 g/L，比出發菌株發酵水平（0.2 g/L）提高9倍。

根據以上的相關研究報道分析可知，盡管目前可以有效引起生物物種遺傳物質產生變異的化學誘變劑多種多樣，但由于部分誘變劑屬于劇毒化學品，危害以及監管難度較大（例如二氯二乙烷、疊氮化鈉等），無法作為常規的誘變劑進行使用。在長期的三孢布拉氏霉菌選育工作中，NTG、EMS和亞硝酸等化學誘變劑由于使用安全性略高（國際癌癥研究機構2A類致癌物，http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/），因此成為該領域主要的化學誘變手段。其中，NTG更是實際應用過程中最為有效和常用的化學誘變劑。隨著近年來對于公共安全、勞動衛生和安全防護等意識的日益提升，類似NTG等高效化學誘變劑的實驗操作防護、使用和后處理方面的監管也應不斷加大?；贜TG等化學誘變劑對實驗操作人員身體健康威脅的考慮，需要在實驗防護、實驗過程中廢棄物處理、以及實驗過程的管理等方面提出嚴格規范的規程，從而更好地發揮化學誘變技術在生物物種誘變選育中的作用。

1.2.2 物理誘變技術及在三孢布拉氏霉菌組合誘變中的應用

與化學誘變技術相比，物理誘變技術由于不存在誘變劑的殘留問題，因而極大方便了誘變后的篩選和選育操作。目前主要應用于三孢布拉氏霉菌株選育的物理誘變技術有：UV誘變、60Co輻照誘變、離子束誘變等。

UV誘變技術是一種極為簡便且易于推廣的物理誘變技術。例如，顧秋亞[19]采用傳統的UV誘變方法，并利用含有0.025%洛伐他汀和0.05% OP乳化劑的抗性平板對三孢布拉氏霉菌負菌進行定向選育，從而得到一株高產β-胡蘿卜素的菌株，其產量為2.06 g/L，比原始菌株提高了49.3%。另外，由于UV主要通過引起DNA大分子中相鄰的嘧啶形成二聚體，因此主要造成點突變或者局部的DNA分子損傷，加之生物體細胞內具有多種針對DNA點突變損傷的修復機制，因此該方法的實際誘變效率較低。在β-胡蘿卜素高產菌株的誘變選育工作中，該方法多以組合應用的形式，應用于三孢布拉霉孢子的誘變處理操作中（詳見1.2.1節）。

除UV誘變技術之外，常見用于三孢布拉氏霉誘變處理的物理誘變技術還包括：60Co輻照以及離子束處理誘變技術等。該類方法主要是以γ射線以及高能的快中子（10～100 keV）對三孢布拉氏霉孢子中的DNA分子造成大范圍的損傷，從而引起遺傳物質的缺失和重排[20]。童海寶等[21]曾使用60Co輻照等誘變技術對三孢布拉氏霉菌進行了誘變處理，并取得良好的誘變效果。

離子束誘變技術在我國最早于1997年由中國科學院等離子體物理研究所建立，并由邵春林等對離子束輻照引起的生物效應，從能量、質量、電荷三方面建立了協同效應模型（EMC模型）[22]。對于該技術在生物物種改良中的應用及研究進展，周長芳、張寧等[20-23]皆曾進行過系統的論述。國內利用離子束技術對三孢布拉氏霉菌進行選育的研究，最早見于任雙喜等[18]的相關報道（詳見1.2.1節）；除此之外，張寧等[24]也以10 keV的低能氮離子（N+）注入三孢布拉氏霉菌孢子，并篩選得到兩株改良菌株。突變株的β-胡蘿卜素發酵水平達到2.2 g/L，比出發菌株提高20%。隨后，Zhang Ning等[25]又對三孢布拉氏霉負菌CK03孢子進行低能氮離子注入誘變選育，獲得兩株優良性狀的菌株（BH3-701和BH3-728），突變株的β-胡蘿卜素發酵水平從1.835 g/L分別提升至3.280 g/L和3.021 g/L。

此后，Zhang Ning等[26]從抗氧化酶酶活水平上，對低能離子束劑量與三孢布拉氏霉菌孢子存活率之間的關系進行了解析，初步證實孢子極可能借助過氧化物酶和超氧化物歧化酶對自由基的清除，降低離子束輻照對孢子的損傷。該研究結果為改進離子束在誘變中的應用起到重要的指導作用[27]。

1.2.3 原生質體技術在三孢布拉氏霉菌選育中的應用

由于三孢布拉氏霉菌細胞及其孢子具有堅韌的細胞壁和孢子壁結構，因此為細胞抵御化學誘變劑提供了一個天然的“屏障”。有效地去除三孢布拉氏霉菌細胞壁和孢子壁，可以提高菌體細胞遺傳物質對物理和化學誘變劑的敏感性，有可能獲得意想不到的誘變效果。

早在1999年，單志萍等[28]就曾對三孢布拉氏霉原生質體的制備及再生技術進行了系統的研究。通過利用溶壁酶、纖維素酶和蝸牛酶進行組合優化，使得原生質體制備濃度達到8.0×106個/mL；隨后，借助于原生質體液體再生技術，使得原生質體再生率達到40%。2002年，該課題組又利用高濃度NTG（100 μg/mL）對三孢布拉氏霉JMβ817孢子進行處理，從而得到功能上為單核的孢子，并以此為基礎進行原生質體的制備。通過對原生質體進行UV誘變處理和再生，得到深黃色的突變株。其β-胡蘿卜素產量達到2.36 g/L，比出發菌株提高了30%[29]。2007年，鄔春艷[30]通過三孢布拉氏霉菌原生質體的制備，并利用UV誘變以及原生質體融合技術，從而獲得1株具有優良遺傳穩定性的重組菌株。

除此之外，國內外學者利用原生質體制備技術，也對三孢布拉氏霉菌的基因工程研究進行了大量的研究探索。2008年，Li Ye等[31]利用蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶進行復配，成功制備了三孢布拉氏霉菌原生質體。原生質體制備濃度為7.48×106個/mL，再生效率達到（77.5±2.70）%。基于原生質體轉化技術，外源GFP編碼基因的表達以及RNA干擾技術相繼在三孢布拉氏霉體系得以實現。2011年，黃瓊瑤[32]又嘗試利用原生質體轉化技術，以實現雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）β-胡蘿卜素羥化酶基因（crt-Z）和酮化酶基因（crt-W）在三孢布拉氏霉中的表達。但由于原生質體再生效率較低（制備效率約為2.2×106個/mL），因此該法的應用效果與農桿菌及基因槍介導的基因轉化方法尚有一定的差距。

由此可見，雖然各課題組制備三孢布拉氏霉菌原生質體的制備效率皆達到相同的技術水平，原生質體的再生效率水平卻高低不一，原生質體技術在三孢布拉氏霉菌菌種選育的應用尚屬起步探索階段。系統的開展原生質體制備及其對再生效率影響的研究，提高所獲原生質體的存活率，將是推動該技術在三孢布拉氏霉菌育種與代謝工程相關研究的重要發展方向之一。

根據三孢布拉氏霉菌誘變選育技術的研究報道分析可知，該領域的發展方向除不斷嘗試和開發各類誘變技術外，其應用過程更以NTG化學誘變為主要手段，并以此形成各類物理和化學誘變技術組合應用的發展特點。由于三孢布拉氏霉菌為多核真菌的特點，通過較高的誘變劑量（例如NTG使用的濃度劑量），可以通過提高孢子致死率的方式，破壞大多數細胞核維持細胞正常生理代謝的功能[6,16]，并以此確保突變株的遺傳穩定性。如能在分子水平上揭示三孢布拉氏霉菌生長及孢子形成過程中的細胞核復制及調控基本規律，通過基因工程或者各類調控手段獲取單核或者少核的菌株孢子，將對三孢布拉氏霉菌的誘變育種工作產生積極的促進作用。

1.3 三孢布拉氏霉菌選育過程中高效篩選技術的應用

選擇性培養基是一類根據某種微生物的特殊營養要求或抗性而設計的培養基，從而提高特殊功能菌株的篩選效率。早在1995年的專利中，Finkelstein等[14]就曾建議，通過在固體培養基中添加抗高膽固醇藥物（例如：洛伐他?。?、抗高血脂藥物、乙酰輔酶A合成抑制劑、類胡蘿卜素合成抑制劑、類異戊二烯合成抑制劑、自由基產生劑（例如杜醌）以及β-紫羅蘭酮等，皆能起到定向篩選β-胡蘿卜素高產菌株的作用。

根據文獻報道[33-35]，洛伐他汀是篩選β-胡蘿卜素高產菌株常用的抑制劑。由于洛伐他汀（尤其是其水解后的酸性結構）是羥甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）結構類似物，因此可以通過底物抑制效應而降低羥甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）的酶活力，從而降低膽固醇生物合成，甚至干擾脂肪代謝，以致影響細胞正常生理代謝。通過誘變處理，部分突變株HMGR的編碼基因由于發生突變，從而可能解除HMG-CoA及其結構類似物對HMGR的抑制作用，因此能在含有洛伐他汀的培養基中得以存活。另外，突變株由于不再受HMG-CoA的抑制，因而β-胡蘿卜素合成的代謝通量得到顯著提高。國內顧秋亞[19]、劉海麗[12]等也曾將該技術進行應用，并取得良好的篩選效果。

在本實驗室研究中發現，隨著對三孢布拉氏霉菌進行不斷的選育，突變株甚至能夠在高濃度洛伐他?。ǜ哌_2 g/L）環境下正常生長。推究該現象可能系突變株的HMGR在長期的誘變篩選過程中，逐步降低甚至完全喪失對洛伐他汀的敏感性；甚至有可能借助耐藥機制的產生，而使突變株對洛伐他汀產生耐藥性?；讦?胡蘿卜素合成過程中有多種酶參與其合成代謝，因此充分了解相關酶的表達調控及構效機制，針對不同酶開發并合理選擇新型高效抑制劑進行組合運用，可以利用定向進化[36]以及核糖體工程[37]等技術強化β-胡蘿卜素合成代謝通量，以取得良好的選育效果。

2 三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素工藝的優化

三孢布拉氏霉菌作為目前生產β-胡蘿卜素的主要工業菌株，國外早在20世紀50年代就開始對該過程工藝進行系統的研究[38]。有關三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素的研究，按照反應器的類型分為：搖瓶、攪拌槳式反應器以及氣升式反應器發酵；如按照發酵培養方式，主要以批次發酵和補料分批發酵為主。根據三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素工藝的特點，科研工作者對接種方式、培養基組分、發酵工藝參數和反應器進行了系統的研究和探索，并逐步開發出符合工業化生產要求的工藝，使得β-胡蘿卜素的發酵生產水平以及過程經濟性得到不斷的提高。

2.1 三孢布拉氏霉菌正負菌接種方式的研究進展

無性孢子的形成和萌發、菌絲體的斷裂和生長、以及接合孢子的形成和萌發是三孢布拉氏霉菌主要的細胞增殖方式[8]?；谌卟祭厦咕纳砗痛x特點，通過將正負菌分別進行無性培養，并在發酵過程中進行混合配對，可以有效提高對發酵過程中正負菌比例的控制，從而實現β-胡蘿卜素的高水平發酵需求。針對該菌株特殊的生理和代謝特點，早在20世紀60年代，國外科學家就已經開始對三孢布拉氏霉菌種子液制備及接種方式進行系統的研究，并不斷對不同的研究目的發展出各具特色的工藝類型。

2.1.1 利用斜面培養物分別制備三孢布拉氏霉菌正負菌種子液

早期β-胡蘿卜素發酵所需種子液，以接種正負菌株斜面培養物的方式進行制備。Ciegler等[38]通過將NRRL2456（正菌）和NRRL2457（負菌）斜面培養物接種于種子培養基，并分別按照5%的接種量實現兩菌株的混合發酵。隨后，Ciegler等[39]利用20 L發酵罐開展β-胡蘿卜素發酵研究發現，發酵種子液制備方法及接種操作會對β-胡蘿卜素發酵水平產生不同程度的影響。其中，將正負菌株種子液分別直接接種發酵的工藝，其β-胡蘿卜素發酵水平明顯優于正負菌種子液預混合孵育的發酵工藝。當正菌與負菌接種體積比為1∶1（總接種量為10%）時，β-胡蘿卜素發酵水平最佳，但總接種量對β-胡蘿卜素發酵水平無顯著影響。

對于搖瓶發酵而言，由于正負菌種子液的制備過程中有時會出現菌絲體相互纏繞形成較大的菌團或者菌塊，因此較小體積規模的發酵很難實現接種時的均勻定量控制。為解決該問題，Dandekar等[40]分別將三孢布拉氏霉菌正負菌的斜面培養物接種于含有10 g/L麥芽汁的種子培養基中，通過對培養得到的正負菌菌絲體分別進行均質分散，以此作為批量搖瓶發酵的種子液。通過該方法，Dandekar等證實環腺苷酸參與了三孢布拉氏霉菌三孢酸和β-胡蘿卜素的合成、菌體生長、繁殖以及菌體形態發育等諸多生理代謝過程的調控，但種子液均質對β-胡蘿卜素發酵的影響卻并未見詳盡的報道。

2.1.2 三孢布拉氏霉菌孢子接種分別制備正負菌種子液

與接種斜面培養物制備發酵所需種子液的方法相比較，孢子由于分散均勻且可以通過顯微技術等方法進行快速定量，因此有利于菌種接種的定量控制。2006年B?hme等[41]發現，正菌孢子萌發時間遲緩于負菌孢子，但后期正菌菌絲體生長速度卻明顯快于負菌?；谠摤F象，該研究組對正負菌種子液的培養時間以及合適的接種菌齡進行了系統的研究。當孢子接種量約為1.7×103個/mL時，種齡為20 h的負菌種子液與種齡為24 h的正菌種子液適宜接種發酵。當正負菌種子液以1∶30的體積比進行配對發酵時，β-胡蘿卜素發酵水平最佳，達到0.45 mg/L。潘鵬等[42]利用正負菌株孢子懸浮液進行種子液制備時也發現，正菌細胞量增長速率顯著快于負菌，正負菌種子液適宜接種的種齡分別為12～15 h和25～30 h。通過接種量和接種比例的優化發現，正負菌種子液接種總量為20%，且體積比控制在2∶3時，β-胡蘿卜素發酵水平最佳，達到12.2 mg/L。

2.1.3 三孢布拉氏霉菌正負菌孢子混合直接接種發酵

有關直接以正負菌株孢子混合接種發酵的方法，Kim等[43-44]于1997年曾對此進行了應用。該課題組以1×105個/mL孢子接種量，直接將正負菌株的孢子接種于50 mL發酵培養基中（250 mL搖瓶），并對司盤、吐溫和曲拉通3 類表面活性劑進行了篩選和優化。研究發現，司盤-20對β-胡蘿卜素以及三孢布拉氏霉菌合成中間代謝物三孢酸皆具有較好的促進作用，發酵水平可達2.3 g/L，比不含司盤-20的對照組提高2.7倍。隨后，該課題組通過接種5×106個正菌孢子和1×107個負菌孢子，系統研究了H2O2對β-胡蘿卜素發酵的影響。結果表明，發酵培養基中添加10 μmol/L的H2O2，可以使菌絲體中的β-胡蘿卜素含量比對照組提高約46%[45]。由于孢子直接接種操作簡單，兼之搖瓶發酵體積較小，因此該方法極大地提高了工作效率，適宜于對大量的實驗考察因素進行快速的篩選判別。

綜上所述，三孢布拉氏霉菌發酵種子液的擴大培養，作為實驗室研究成果向工業化生產逐步放大中必須面對的技術環節，其研發歷程呈現如下特點：種子液接種方式從簡單的斜面培養物直接接種，逐步發展到精確定量接種孢子；而發酵接種控制則從簡單的體積混合配比，逐步強化至根據菌齡和菌體濃度和菌體濃度進行接種量和接種比例的定量控制。

由于曾有報道三孢布拉氏霉菌負菌孢子無法進行大量的制備[46]，加之工業大規模發酵需要大量的種子液以滿足大規模發酵制備的需求，因而定量接種孢子并對無性培養的正負菌種子液進行逐級放大的工藝，則是三孢布拉氏霉菌接種控制及種子液制備的主要方法。另外，由于其他接種和種子液制備方法具有操作簡便等技術優勢，因此通過對其進行不斷的完善和改進，亦可使其在諸如菌種選育與發酵培養基篩選等特定研究工作中發揮獨特的作用。

2.2 三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素培養基優化的研究進展

培養基種類和組成是實現β-胡蘿卜素發酵的基本條件之一，其中碳源、氮源以及油脂是三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素用量最大，生產成本所占比重最高的3種培養基組分。通過對主要培養基組分進行篩選以及優化，是提高β-胡蘿卜素發酵水平，并降低生產成本的常用手段。

2.2.1 發酵培養基碳源和氮源的篩選和優化

碳源和氮源是細胞生長過程中能量供應以及合成細胞物質的重要原料，其中碳源更是合成β-胡蘿卜素的主要原料。早在20世紀50年代，Ciegler等[38]就曾以各類谷物及其加工副產品作為碳氮源進行β-胡蘿卜素的發酵研究。近年來，Choudhari等[47]亦曾對各種常見的碳源進行過系統的比較，其中以60 g/L葡萄糖作為碳源時，β-胡蘿卜發酵效果最佳。另據研究報道[24]，以玉米淀粉替代葡萄糖進行進行β-胡蘿卜素發酵，可以取得更好的應用效果；但基于發酵成本的考慮，玉米粉可能具有較好的應用潛力。除此之外，也有研究者嘗試使用一些廉價的碳源，如甜菜或甘蔗廢糖蜜[48]、工業甘油[49]、以及制糖、奶酪和乳品制造行業的工業廢水[50]等生產β-胡蘿卜素。近年來，隨著基于糖平臺生物煉制過程的不斷發展，從自然界尋找更為廉價的碳源已成為可能，這也為提高β-胡蘿卜素發酵過程的經濟性指標提供新的契機。

據研究報道[51-54]，黃豆粉是目前β-胡蘿卜素發酵最為常用的氮源。近年來，張寧等[24]研究發現，豆粕和棉籽蛋白亦皆具有較好的應用效果，其中又以30 g/L棉籽蛋白對菌體和β-胡蘿卜發酵促進效果最佳。雖然，Choudhari等[47]研究指出，在其考察的氮源中，1 g/L的酵母提取物對細胞生長以及β-胡蘿卜發酵促進作用最佳，其次為大豆蛋白胨和牛肉蛋白胨，而相同條件下豆粕的影響幾乎可以忽略不計。但由于酵母提取物營養成分豐富，因此經常被用作微生物生長因子的重要來源，但由于其價格較高，因此常以玉米漿作為其替代物。Goksungur等[55]的研究表明，50 g/L的玉米漿可以有效替代1.0 g/L酵母提取物應用于β-胡蘿卜發酵。

由于三孢布拉霉菌高效發酵制備β-胡蘿卜是基于菌體的大量繁殖以及β-胡蘿卜大量累積的過程，因此合理的平衡培養基中的碳氮源組成，確保合理的生物量，可以避免碳源和氮源的無效消耗，提高培養基成分向β-胡蘿卜的轉化效率。另外，鑒于三孢布拉霉菌發酵制備β-胡蘿卜的培養基組分通常為各類谷物，其中包括了大量的植物蛋白和多糖成分。為了快速的利用這些大分子化合物，三孢布拉霉菌除需要利用碳氮源合成細胞物質之外，還要合成大量的水解酶，以實現培養基成分的充分利用。合理的選擇培養基組分，并對其進行適當的預處理，將可以有效的提高培養基中大分子物質的利用速率，同時亦可提高原料的轉化效率。

2.2.2 發酵培養基植物油脂成分的篩選和優化

三孢布拉氏霉菌發酵β-胡蘿卜素的過程中，植物油的添加可以為細胞的合成代謝提供額外的大量能量和碳骨架，同時亦可作為前體物質用于β-胡蘿卜素的合成代謝。而葡萄糖作碳源，盡管也可以轉化為短鏈脂肪酸參與β-胡蘿卜素的生物合成，但大部分通過三羧酸循環而參與能量代謝。

近幾年，張寧[24]、顧秋亞[56]、Choudhari[57]和Papaioannou[58]等曾分別系統比較了棉籽油、大豆油、亞油酸、葵花籽油、橄欖油、棕櫚油、玉米油、葵花油和花生油對三孢布拉氏霉菌生長以及β-胡蘿卜素合成的影響。在所考察各類植物油中，最常用的為棉籽油和大豆油，其中又以棉籽油對β-胡蘿卜素發酵的促進效果最佳[56]。張寧[24]、Papaioannou[58]等研究表明，在其考察的植物油脂中，大豆油和橄欖油對菌體生長的促進作用最佳，而棉籽油以及含有較高亞麻酸的葵花籽油最有利于β-胡蘿卜素的發酵。然而Choudhar等[57]卻研究發現，30%葵花籽油和橄欖油雖然可以促進菌體的生長，但對β-胡蘿卜素合成卻有抑制作用；而棕櫚油、橄欖油和玉米油雖然能獲得良好的生物量，然而β-胡蘿卜素發酵得率較低。在其所考察植物油脂中，以大豆油對β-胡蘿卜素促進效果最佳。廖春麗等[59]利用響應面法優化發酵培養基時曾發現，在其考察的濃度范圍內，檸檬酸、黃豆粉氮源和棉籽油相互間存在交互作用，并最終影響菌株的β-胡蘿卜素發酵水平。不同課題組研究之間的巨大差異，可能與發酵所用的菌株或者培養基組成及其含量的差異有關。

雖然植物油的存在提高了真菌的生物量和類胡蘿卜素的含量，但是培養基中植物油濃度偏高，亦會增加發酵液的黏稠度，從而影響搖瓶內的溶氧水平和菌體對底物的吸收利用[39]。另據研究報道[56]，油脂有可能通過將細胞中的β-胡蘿卜素溶解，從而部分解除產物抑制，提高β-胡蘿卜素的產量。

2.2.3 發酵促進劑對β-胡蘿卜素生物合成的影響

在三孢布拉氏霉發酵過程中，當發酵培養基和發酵工藝條件已確定，加入一些發酵促進劑可以影響β-胡蘿卜素生物合成途徑中的關鍵酶活性，通過對代謝途徑的調控，從而有效提高β-胡蘿卜素的產量；表面活性劑的加入有利于菌體對培養基中植物油的利用；抗氧化劑的存在則可以避免已經生成的β-胡蘿卜素被氧化。

2.2.3.1 類胡蘿卜素的前體及結構類似物

類胡蘿卜素的前體及結構類似物，如β-紫羅酮[38]及其替代原料如苧烯、檸檬油、芳香族化合物[60]。β-紫羅酮可激活生物合成途徑中的甲羥戊酸激酶，該酶是胡蘿卜素生物合成途徑中主要的限速酶。通過在發酵過程中對β-紫羅酮的補加，能有效地提高β-胡蘿卜素的產量[61-62]。劉月英等[63]在研究紅酵母COS-5產胡蘿卜素工藝時發現，通過添加鹽酸硫胺素、橘子皮汁（含紫羅酮）、蕃茄汁（含八氫蕃茄紅素和四氫蕃茄紅素等β-胡蘿卜素和其他類胡蘿卜素的前體），均對該菌生物合成β-胡蘿卜素有促進作用。顧秋亞等[56]研究了不同代謝促進劑對三孢布拉氏霉菌菌體生長和產物代謝的影響，其中，β-紫羅酮效果最佳，但由于其對早期的菌體生長具有毒性，故最佳補加時間為菌體生長進入穩定期后。

另外，一些化學添加劑能夠影響很多微生物類胡蘿卜素的產生。Tang Qiong等[64]研究了麥角甾醇合成抑制劑-酮康唑對三孢布拉氏霉hmgR基因和carRA基因轉錄的影響。結果顯示，酮康唑觸發了hmgR基因的轉錄，從而提高了β-胡蘿卜素和輔酶Q10的含量。研究發現[65]基因carB與carRA是β-胡蘿卜素的生物合成途徑的關鍵基因，一定濃度的花生四烯酸[53]能使hmgR、carRA、carB基因轉錄平提高，并使β-胡蘿卜素產量提高。

2.2.3.2 表面活性劑類發酵促進劑

由于發酵培養基中添加了大量的植物油，為了更好地利用植物油，可以對其添加表面活性劑，利用表面活性劑的兩性改變微生物細胞膜的通透性和細胞表面的極性，使菌絲體分散比較均勻，從而進一步改變菌絲體的生理學性質和發酵液的流變性，刺激菌體生長與呼吸；同時，表面活性劑的乳化作用可以提高菌體的脂肪酶活性，促進菌體對植物油的分解和利用，最終提高β-胡蘿卜素的產量[52]。

研究發現，在三孢布拉氏霉菌發酵培養基中加入一定濃度的Span-20[43-44]，OP乳化劑或吐溫[52]均能有效的提高β-胡蘿卜素產量。大豆卵磷脂是一種兩性表面活性劑，研究發現[62,66]，向發酵培養基中添加大豆卵磷脂可以提高β-胡蘿卜素的產量，并有效降低γ-胡蘿卜素的產量，使目標產物更趨集中。

2.2.3.3 三羧酸循環中間產物類發酵促進劑

三羧酸循環中間產物在有氧代謝中發揮著重要作用，形成微生物類胡蘿卜素的碳架。在培養基中添加一定量的檸檬酸和蘋果酸，能夠刺激類胡蘿卜素的產生[67]。王常玲等[66]研究發現，發酵初期加入檸檬酸可以促進菌體的初級代謝，增強菌體的呼吸作用，使三孢布拉氏霉菌的生物量增加很快，從而為大量生產β-胡蘿卜素提供基礎。

2.2.3.4 抗氧化劑類發酵促進劑

β-胡蘿卜素為類萜化合物，其結構含有許多雙鍵，因此對氧很敏感，可以考慮在發酵后期向發酵液中添加抗氧化劑保護已生成的β-胡蘿卜素。劉海麗等[52]研究發現，當添加的抗氧化劑乙氧喹為最佳濃度時，β-胡蘿卜素產量增幅達70%。Nanou等[68]研究發現，三孢布拉氏霉菌發酵產類胡蘿卜素，加入20 mmol/L的抗氧化劑丁化羥基甲苯時，得到的類胡蘿卜素為125 mg/g干菌體。

綜上所述，培養基組分篩選優化的相關研究，由于考察對象多、實驗工作量大，采用可靠的數學模型對實驗方案及結果進行統計分析，可以大大提高工作效率。尤其是有些培養基組分，很難用傳統的碳源、氮源以及富含生長因子的組分進行清晰的界定，更不宜用簡單的濃度均一考察或者碳氮含量歸一處理進行組分的篩選。令人鼓舞的是，在近年來的研究工作中，除單因素考察法之外[47]，部分因子設計[69]、中心復合設計[70]、中心復合設計與均一精密[47]、遺傳算法[71]以及響應面分析[47,70]等數學工具的大量應用，不僅方便了對發酵培養基多組分的全局優化及組分間交互作用的分析，而且有效促進了培養基組分優化等研究工作的高效開展。

2.3 三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素過程工藝參數的優化

2.3.1 溫度對發酵產β-胡蘿卜素影響的研究

溫度可以通過影響各種酶反應的速率，從而改變菌體內各代謝途徑的通量，并以此最終影響產物的合成速率甚至微生物的代謝方向。低溫時微生物從環境中攝取營養的速率下降，同時代謝活動減弱，如蛋白合成速率也下降，生物膜功能被干擾；而類胡蘿卜素量的增加和脂類的不飽和化都是對低溫時生物膜功能減弱的補償[67]。有研究表明，在28～30℃發酵將會增加β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素的含量，而產生番茄紅素的最佳溫度為25℃[47,72]。

2.3.2 發酵液pH值對發酵產β-胡蘿卜素影響的研究

pH值的變化與培養基的組分尤其是碳氮比有很大的關系。在三孢布拉氏霉搖瓶發酵過程中，隨著細胞對葡萄糖的快速吸收利用，二氧化碳的釋放和有機酸的生成，導致發酵液的pH值很快下降到較酸的水平，隨后緩慢上升，到發酵終止時pH值達到最高，可能是由于細胞的死亡、溶解導致胺代謝產物的釋放造成的[73]。Mantzouridou等[70]研究了在基礎培養基中不同初始pH值（6.0～11.0）對細胞生物量和β-胡蘿卜素產量的影響，在pH值為7.0時獲得的β-胡蘿卜素（170.0 mg/L）為最高。Choudhari等[47]研究了初始pH 4.0～10.0的培養基對β-胡蘿卜素的產量影響，在pH 6～7獲得較高的產量為（99±1）mg/L。Kim等[74]則發現，利用堿性培養基（培養基滅菌前的初始pH值為10.0）可以得到較高的β-胡蘿卜素產量。由于未對滅菌前后的培養基組分以及pH值變化進行分析，因此較難以推斷高pH值對β-胡蘿卜素合成的促進作用機理。通常情況下，糖分在高溫及高pH值條件下其穩定性較差，但高pH值和高溫環境可能有利于培養基中蛋白成分的水解，從而有利于菌體的生長利用。因此，如果能夠通過嚴格的實驗設計（例如接種前調節發酵培養基的pH值）以及發酵過程中的pH值和組分分析監控，將有助于得到更為確切可靠的研究結論。

2.3.3 溶解氧對發酵產β-胡蘿卜素影響的研究

在搖瓶培養時，搖床轉速固定的前提下，裝液量的變化決定著培養基中溶解氧濃度的高低，從而影響細胞對氧的需求，而發酵罐中則可以通過提高攪拌轉速和通氧量來改善。Nanou等[75]發現，在250 mL錐形瓶中放入25 mL培養基（氣液相體積比為9.0）時，可使類胡蘿卜素的產量達到最大115 mg/g干生物量；但是繼續提高溶解氧水平至15.7（即氣液相體積比為15.7）時，有可能極高濃度的活性氧會引起三孢布拉氏霉的氧化應激反應，從而導致類胡蘿卜素的含量下降。另有研究結果表明[76]，發酵液中的菌絲球在較高的溶氧環境下會解體形成分散的菌絲體，從而有利于營養物質和氧氣的傳遞和利用，以此提高β-胡蘿卜素的發酵水平。

除增加氧氣的供應之外，添加氧載體也可提高同一反應系統的傳氧系數。有研究表明，通過在發酵過程中加入攜帶大量氧氣的乳化植物油，可以有效的提高β-胡蘿卜素的發酵水平[77]。另有研究也系統考察了HO[45,78]、22液體石蠟[54]、正己烷和正十二烷[79]作為氧載體對β-胡蘿卜素合成的影響，發現以上氧載體在一定濃度下可刺激微生物的β-胡蘿卜素形成，高于此濃度，其毒性可導致β-胡蘿卜素產量大大下降。

2.3.4 發酵產β-胡蘿卜素培養方式的研究進展

對三孢布拉氏霉菌進行補料分批培養，可達到很高的生物量和β-胡蘿卜素[80]，向發酵罐中通入純氧并間歇性補加葡萄糖，既可以控制罐中由于表面活性劑等產生的泡沫，合適的溶解氧濃度也利于菌體生長和產物生成[73]。Nanou等[81]研究了在鼓泡床反應器中通過提高通氣量誘導氧化壓力，并研究了三孢布拉氏霉菌的形態改變情況，在通氣量為4 vvm時，得到類胡蘿卜素最高產量（55.0±2.5）mg/g干菌體，其中β-胡蘿卜素的含量占91.68%。Mantzouridou等[82]考察了在攪拌反應釜中，通氣量和攪拌速度對三孢布拉氏霉菌的形態及發酵產β-胡蘿卜素的影響。在通氣量為1.5 vvm、葉輪轉速150 r/min條件下，β-胡蘿卜素最高質量濃度達到1.5 kg/m3。Perez等[62]通過在發酵中期多次流加含10% β-紫羅酮的植物油，使β-胡蘿卜素的產量達到8.7 g/L。許新德等[77]在三孢布拉氏霉菌發酵培養24 h后分批補加植物油，不僅保持了培養基黏度的均一性，還提高了植物油利用率，進而促進了三孢布拉氏霉的產能。

3 反應器工程技術在三孢布拉氏霉菌發酵產β--胡蘿卜素中的應用

三孢布拉氏霉菌屬于高度好氧的微生物，在其發酵培養的過程中，由于培養基黏度大，固形物（包括大量生成的菌體）含量高，生長過程中菌絲體容易糾結成團，導致發酵系統的溶氧速率較低。在發酵罐中如若加大攪拌力度，則會造成菌絲體的損傷，使生產能力下降[73]。

在早期的研究中，童海寶等[83]曾通過使用上、中層為寬葉推進式，下層為渦輪式的組合式攪拌槳葉，在提高了發酵液的傳質性能和氣液接觸效率的同時，降低對菌絲體的剪切損傷，發酵水平達到2.0 g/L以上。另外，譚新國等[84]也系統比較了不同槳型的攪拌槳對β-胡蘿卜素產量的影響。在最佳攪拌形式下，β-胡蘿卜素發酵水平達到（1.547±0.305）g/L，比反應器優化前的發酵水平提高了5.05倍。

與攪拌型反應器相比，升式反應器可以利用通入的空氣引起氣液環流，實現發酵液的全混和攪拌，提高傳質系數。在滿足生物量對高溶氧要求的同時，減小了剪切應力對細胞的損傷，因此廣泛應用于植物和絲狀真菌的發酵培養[85-87]。姜文侯等[88]通過應用3 000 L氣升式反應器培養三孢布拉氏霉菌，實現了β-胡蘿卜素的發酵制備，在27℃發酵114 h，β-胡蘿卜素產量達到1.328 g/L。此外，Varzakakou等[87]通過利用1.4 L玻璃氣升式反應器，對β-胡蘿卜素發酵過程中的三孢布拉氏霉菌自溶機理進行了探討，對發酵過程中胞內的水解酶酶活力分析發現，蛋白酶以及幾丁質酶直接介導了該過程。

對于三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素過程而言，由于發酵液生物量大，加之該菌種典型的低等絲狀真菌，且β-胡蘿卜素為胞內產物，因此對于發酵過程中的物質、能量和動量傳遞提出了更高的要求。如能在反應器尺度上針對該發酵過程進行針對系統的研究，將可以有效的挖掘菌株的生產潛能、提高過程的經濟性指標。因此，新型反應器的開發和應用，將不失為促進 該領域取得突破性進展的重要研究方向。

4 結 語

在過去的半個多世紀里，三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素的研究一直隨著生物工程和化工過程等相關學科的發展而不斷深入。其中高通量菌種選育技術的開發和代謝工程研究的不斷深入，將是獲取高效細胞工廠的重要研究方向。對三孢布拉氏霉菌生理和代謝等基礎研究的開展，不僅能夠揭示三孢酸類物質生成及對β-胡蘿卜素合成的調控機理，而且有助于創造全新的細胞，以實現單一菌株的發酵過程。如能利用代謝工程等手段，使纖維素酶等外源基因通過三孢布拉氏霉菌進行高效的分泌表達，更可能實現對木質纖維素等廉價碳源的直接利用。此外，通過對β-胡蘿卜素發酵過程工藝的優化和強化控制，也為細胞工廠的有序運行提供重要的物流保障。通過合理的實驗設計，并對各類常用的培養基組分進行科學系統的評價，不僅可以獲得合理的培養基組分，而且通過經濟的預處理方式以及補料流加策略的優化，亦可以強化對發酵過程菌株生長及代謝的過程控制，提高β-胡蘿卜素發酵的效率?；诜磻鞒叨鹊纳锇l酵過程研究，是利用工程手段有效解決生物過程問題的重要手段。通過新型反應器的設計和研發，不僅可以為三孢布拉霉菌的生長以及β-胡蘿卜素的合成提供適宜的外在環境，更可能通過質量和能量傳遞的改善，而使整個過程更為經濟。

隨著人們對生活品質的要求越來越高，以及對綠色天然產品的倡導，天然β-胡蘿卜素的市場需求將會越來越大。三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素作為生物化工領域一個典型的混合菌發酵過程，雖然有其本質的缺陷，但也有其獨特的過程優勢。相信在相關科研工作者的努力之下，該研究方向會不斷取得突破進展，進而建立起全新的發酵模式，并在其他高附加值產品的研發上綻放出新的生機和活力。

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