聚酰胺色譜法分離油茶蒲提取物中抑制5α-還原酶的活性部位

鄭茜茜，夏博能，沈 駿，吳曉琴，沈建福

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

5α-還原酶（5 alpha-reductase，EC1.3.99.5）是定位于靶細胞微粒體上的膜蛋白，依賴還原型輔酶ⅡNADPH作為供氫體，催化還原雄激素睪酮（T）轉變為活性更強的雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）[1]。5α-還原酶異常表達將會導致組織中DHT積聚，DHT含量過高會引起某些疾病如良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、多毛癥、男性脫發等，其中BPH 的發病率在60歲男性中為50%，80歲以上男性中高達90%[2]。目前國內外臨床上廣泛使用非那雄胺（finasteride）、度他雄胺（dutasteride）[3]等作為治療藥物。該類藥物的作用機制是通過抑制5α-還原酶活性，阻斷DHT合成來治療BPH，作為合成藥物不僅價格較昂貴而且會產生一定副作用。近些年研究結果發現植物性多酚類、三萜類、甾體類等化合物對5α-還原酶有較強抑制活 性，目前臨床已應用的天然5α-還原酶抑制劑有鋸葉提取物棕（伯泌松）、非洲臀果木提取物（通尿靈）、油菜花粉提取物（前列康）、黑麥提取物（舍尼通）[4-6]等，從天然植物中篩選高效低毒的5α-還原酶抑制劑逐漸成為研究開發的熱點。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）木本植物，為我國重要的木本油料作物，油茶蒲為油茶果的外殼，約占油茶果總質量的2/3，為油茶加工廢棄物[7]，在振興油茶產業的同時有效地開發利用油茶蒲等副產物具有積極的意義。本實驗前期研究證實油茶蒲提取物（oiltea camellia extracts，OCE）對5α-還原酶具有很強的抑制活性[8]，動物實驗也證實OCE能有效改善大鼠前列腺增生癥狀[9]，是5α-還原酶的高效抑制劑。

目前從天然植物中分離提取5α-還原酶抑制活性部位的研究大多數采用硅膠色譜法[10-14]，采用聚酰胺色譜法進行活性部位篩選的研究國內外還未見相關報道。聚酰胺色譜法[15]是指以聚酰胺為吸附劑的吸附色譜法，包括薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）和柱色譜（column chromatography，CC）兩大類。聚酰胺（polyamide）是通過聚酰胺基聚合而成的一類高分子化合物，分子中含有豐富的酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵結合而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離[16]。聚酰胺具有“雙重色譜”的性能，特別適合用于分離黃酮、酚類和醌類等化合物，對鞣質具有極強的幾乎不可逆的吸附作用，故可作為脫鞣方法[17]。本實驗以5α-還原酶的抑制率為指針，采用TLC和CC分離，通過HPLC檢測，篩選抑制5α-還原酶的活性部位，旨在為OCE中抑制5α-還原酶的關鍵化合物制備，及天然植物類5α-還原酶抑制劑開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通白花油茶蒲 浙江省常山縣芳村鎮；AB-8型大孔樹脂 滄州寶恩樹脂有限公司；聚酰胺（100～200 目） 上海源葉生物科技有限公司；聚酰胺薄層板（10 cm×20 cm，10 cm×10 cm） 北京京京未來科技發展有限公司；沒食子酸標準品（純度＞99%）國藥集團化學試劑有限公司；鞣花酸標準品（純度＞97%） 比利時Acros公司；3-O-甲基鞣花酸-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖（3-O-methyl-D-glucopyranose，MEAG，純度＞95%） 實驗室自制；乙腈、甲醇（色譜純）美國Merk公司；其他試劑均為國產分析純。

雌性SD大鼠3 只，體質量250～300 g 浙江大學紫金港動物中心。

睪酮（T）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）美國Sigma公司；1,4-二硫代蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT） 國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BS124S萬分之一電子分析天平 德國Sartorius公司；RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；玻璃層析柱（Φ3.6 cm×40 cm）、BSZ-100自動部分收集器上海滬西分析儀器廠；XY層析缸（10 cm×20 cm）上海暢輝化工儀器有限公司；玻璃點樣毛細管（內徑0.3 mm） 華西醫科大學儀器廠；Waters 2695高效液相色譜儀（配有2996 PDA檢測器） 美國沃特世公司；Unitary Luna C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）北京華譜新創科技有限公司；Centrifuge 5810R高速離心機 德國Eppendorf公司；Himac CP-80β超高速離心機日本日立公司；T10BS25勻漿機 德國IKA公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶蒲提取物的分離純化

1.3.1.1 油茶蒲提取物的制備

將油茶蒲干燥，粉碎至60 目，用50%（V/V）乙醇溶液85 ℃（料液比1∶10）熱回流提取2 h，過濾，濾液減壓濃縮去除乙醇后上AB-8大孔樹脂柱，以40%（V/V）乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，即可制得油茶蒲提取物（oiltea camellia extracts，OCE），總酚含量為（37.58±1.68）%。

1.3.1.2 聚酰胺薄層層析

聚酰胺薄層層析采用的展開劑為正丁醇-甲醇-水-冰醋酸（體積比為3∶2∶2∶1）；顯色劑為0.5 g/100 mL FeCl3-乙醇溶液。

將新鮮配制的展開劑加入到層析缸中，密閉放置15 min。用毛細管分別吸取適量供試液，以垂直方向小心接觸薄層板面，做條帶狀點樣，點樣基線距底邊1 cm，樣品原點之間距離1.5 cm。將點樣后的薄層板放入已達預平衡的層析缸中，密閉，上行展開，薄層板浸入展開劑中的深度要求溶劑的液面距原點約5 mm，展開至8 cm展距后，立即取出薄層板，晾干，以備檢測。將已晾干的薄層板放入裝有顯色劑的容器中，待充分顯色后取出晾干[18]。根據比移值Rf合并相近組分，分離部位分別減壓濃縮干燥，稱量Fr干基質量，進而計算各Rf值相近組分的得率。

式中：L為原點中心到譜帶中心的距離/cm；L0為原點中心到溶劑前沿的距離/cm。

1.3.1.3 聚酰胺柱層析

聚酰胺預處理：用95%（V/V）乙醇溶液浸泡聚酰胺粉24 h，溶脹后濕法上柱。用3～4 倍柱體積的95%乙醇溶液洗至流出液透明為止，再依次用2.5 倍柱體積的5 g/100 mL NaOH水溶液、1 倍柱體積的蒸餾水、2.5 倍柱體積的10%（V/V）醋酸水溶液洗脫，最后用蒸餾水洗至流出液pH值呈中性，備用。

裝柱：將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，濕法上柱，裝柱后液面必須高于樹脂20～40 mm，讓聚酰胺自由沉降，待穩定后用適量洗脫液沖洗樹脂柱。

上樣：將OCE充分溶解于適量洗脫 劑中，上樣至經過預處理的聚酰胺樹脂柱。

洗脫：用正丁醇-甲醇-水-冰醋酸（3∶2∶2∶1）混合液洗脫，流速1 mL/min，流出液每5 min分管自動收集。

1.3.2 高效液相色譜法（high performance liq uid chromatography，HPLC）檢測

1.3.2.1 進樣液制備

OCE及Fr1～Fr7用蒸餾水配成1 mg/mL溶液，用甲醇配制沒食子酸標準貯備液（0.216 mg/mL），用二甲基亞砜配制鞣花酸標準貯備液（0.223 mg/mL），用甲醇配制MEAG標準貯備液（0.226 mg/mL），過0.45 μm濾膜后進樣檢測。

1.3.2.2 檢測色譜條件

色譜柱：Luna C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長254 nm；流動相A：乙腈；流動相B：1%乙酸水溶液；梯度洗脫：0～8 min，5%～10% A；8～16 min，10% A；16～25 min，10%～15% A；25～30 min，15% A；30～35 min，15%～20% A；35～40 min，20% A；40～45 min，20%～5% A；45～50 min，5% A。

1.3.3 5α-還原酶的抑制活性檢測

1.3.3.1 試劑的配制

睪酮溶液：精密稱取36 mg睪酮，無水乙醇定容至25 mL，濃度為5 mmol/L。

NADPH四鈉鹽溶液：精密稱取NADPH四鈉鹽42.5 mg，用蒸餾水溶解并定容至25 mL，濃度2 mmol/L。

提酶緩沖液：0.32 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5。

反應液：1 mmol/L DTT，40 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5。

1.3.3.2 大鼠5α-還原酶的制備方法

取清潔級雌性SD大鼠3 只，禁食不禁水過夜后脫頸椎處死，取出肝臟冰臺上剪碎。用預冷的緩沖液和玻璃勻漿器制成1∶5勻漿，4℃、10 000×g條件下離心15 min，取胞漿部分100 000×g條件下離心1 h，倒掉上清，沉淀即為粗微粒提取物。加入一定體積緩沖液，并用勻漿器進行勻漿懸浮。分裝，-80 ℃冰箱保存。

1.3.3.3 5α-還原酶蛋白質含量測定

利用考馬斯亮藍試劑盒測定5α-還原酶懸濁液蛋白質的質量濃度（g/L）。

1.3.3.4 5α-還原酶抑制活性測定

2 mL反應體系中，睪酮20 μmol/mL，NADPH 40 μmol/mL，酶260 μg，在37 ℃反應液中反應4 min，248 nm波長處檢測（睪酮溶液最大吸收波長，標準曲線y=0.009 9x+0.003 5，R2=0.999 6），抑制率的計算見下式。

式中：A0為空白斜率（乙醇+NADPH+酶）；A1為反應斜率（T+NADPH+酶）；A2為樣品斜率（T+NADPH+樣品+酶）。

2 結果與分析

2.1 聚酰胺薄層層析結果

在薄層層析條件的摸索過程中，由于硅膠比聚酰胺對極性大的化合物吸附作用更強，樣品TLC檢測容易出現分離度不夠（Rf≤0.48）、拖尾嚴重、譜帶黏連等情況，故選擇聚酰胺色譜法。當向展開劑體系中添加一定比例的冰醋酸后，可明顯減少拖尾并改善譜帶形狀。原因在于冰醋酸的添加增加了展開劑的極性，抑制了化合物中羧基解離，從而有利于羧酸類化合物的展開[15]，考慮到OCE總酚含量較高（37.58±1.68）%，所以推測OCE中含有一定量的酚酸類化合物。

圖1 油茶蒲提取物柱層析分離產物Fr1～Fr7的TLC圖Fig.1 TLC pro file of Fr1 through FFrr7

參照1.3.1.3節柱層析方法，OCE上樣8.00 g，柱層析洗脫后共收集410 管，總體積3 026 mL，回收率36.62%，經聚酰胺柱層析后得到7 個分離部位Fr1～Fr7。由薄層層析結果（圖1）可知，OCE分離度顯著，譜帶清晰，無明顯拖尾現象；Fr3、Fr5、Fr6只含單一譜帶，Fr2含3 條譜帶，Fr1、Fr4、Fr7所含化合物未得到有效分離。此外由表1可知，Fr1得率（20.02%）顯著高于其他分離部位，Fr2得率（6.11%）次之，Fr4得率最低（僅為0.62%）。樣品回收率較低是因為聚酰胺對鞣質具有極強的吸附作用，所以OCE中含有的大量鞣質被吸附在聚酰胺柱上未被洗脫，由5α-還原酶抑制率檢測結果可知鞣質類化合物對5α-還原酶無顯著抑制作用，因此用聚酰胺進行脫鞣處理，以利于OCE中活性成分的有效富集。

表1 油茶蒲提取物柱層析分離產物Fr1～Fr7Table 1 Column chromatographic separation of fractions Fr1 through Fr7 of OOCCEE

2.2 HPLC檢測結果

2.2.1 標準品HPLC圖

圖2 標準品HPLC圖Fig.2 HPLC pro file of standard substances

由圖2所知，沒食子酸（gallic acid，GA）、鞣花酸（ellagic acid，EA）、MEAG為OCE中主要特征酚類化合物，出峰時間分別為6.783、39.559、38.541 min。

2.2.2 Fr1～Fr7的HPLC圖譜

圖3 Fr1～Fr7的HPLC圖Fig.3 HPLC pro files of Fr1 through FFrr7

由圖3可知，OCE、Fr1、Fr4、Fr7峰型多樣，顯示其組成較為復雜；Fr2、Fr3、Fr5、Fr6峰型較為單一，顯示其組成較為簡單，主要化合物的純度較高；與標準品HPLC圖對照，發現Fr2中含有GA，Fr7中含有EA，而Fr2、Fr3及Fr4均含有MEAG。

2.3 Fr1～Fr7的5α-還原酶的抑制活性

通過Fr1～Fr7對5α-還原酶抑制活性的檢測，結果表明7 個分離部位中Fr4和Fr5的抑制活性最高，抑制率分別為（73.01±2.93）%和（76.28±1.37）%，比純化前OCE的抑制率（57.79±1.67）%顯著增加，其余4 個分離部位的抑制活性都不及OCE，說明OCE中具有高效抑制活性的關鍵化合物在Fr4和Fr5中得到了有效富集。由于Fr4得率僅為0.64%，明顯低于Fr5的得率2.10%，且HPLC檢測結果顯示Fr4組成較為復雜，因此可以選擇Fr5作為活性部位進一步制備抑制5α-還原酶的單體化合物。

圖4 Fr1～Fr7的 5α-還原酶抑制率Fig.4 Inhibition rates of Fr1 through FFrr7 on 5α-reductase

液相圖譜顯示Fr2中沒食子酸和MEAG的峰面積所占百分比分別為13.63%和80.18%，但Fr2抑制率（39.43%）低于OCE；Fr7中鞣花酸的峰面積所占百分比為35.12%，但Fr7抑制率（50.72%）也低于OCE。圖4結果表明沒食子酸、鞣花酸及MEAG的抑制率均在15%以下，顯著低于OCE的抑制率（57.79%）。由上述推測OCE中抑制5α-還原酶的關鍵化合物并不是沒食子酸、鞣花酸及MEAG。這與Hirano等[19]從娑羅雙屬樹的心材中分離得到5 種鞣質類化合物中沒食子酸和鞣花酸對5α-還原酶沒有抑制活性（5α-還原酶剩余活性分別為99%和97%）的結果吻合。

3 結 論

應用聚酰胺色譜法能夠有效分離純化OCE中抑制5α-還原酶的活性部位。分離純化得到的7個部位中Fr4和Fr5抑制活性最強，抑制率分別為（73.01±2.93）%和（76.28±1.37）%，較OCE純化前的抑制率（57.79±1.67）%顯著增加，其中Fr5得率為2.10%，組成較為單一，這為進一步制備OCE中抑制5α-還原酶的關鍵化合物奠定了基礎。

Hiipakka等[20]通過體外酶學實驗和細胞實驗研究了多酚類物質對5α-還原酶抑制的結構-活性關系，結果發現大多數酚類物質（尤其異黃酮、黃豆苷、染料木黃酮和山萘酚）對5α-還原酶具有較強的抑制活性。油菜花粉、仙人掌、何首烏、交趾黃檀、知母、朝鮮當歸、高良參、楊梅樹皮等提取物均分離出相應的活性化合物[21-23]。課題組前期研究表明，OCE中多酚類物質含量較高（37.58±1.68）%，而且多酚類物質的含量與其5α-還原酶的抑制率成正相關[24]，因此OCE中5α-還原酶抑制的關鍵化合物極有可能是多酚類物質。

天然產物活性成分的層析分離技術中應用最廣泛的是硅膠色譜法。硅膠吸附分離原理是根據物質在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱的物質不易被硅膠吸附，因此極性小的混合物體系適合用硅膠柱等正相吸附劑來分離[25]。以酚酸類化合物為主的油茶蒲提取物（OCE）極性較強，再加上羧基是極性很大的取代基，易解離成鹽，與硅膠吸附較強，所以OCE在用硅膠薄層層析（TLC）做成分預試時極易被硅膠死吸附，造成樣品損失嚴重及分離效果不理想（Rf≤0.48，譜帶黏連，嚴重拖尾）。

適合強極性化合物分離的吸附材料有聚酰胺、反相硅膠、葡聚糖凝膠等，但是反相硅膠、葡聚糖凝膠價格較為昂貴，對于上樣量較大的樣品分離最好選用聚酰胺。聚酰胺對于黃酮、蒽醌等多羥基酚性化合物的吸附分離效果要明顯優于硅膠。聚酰胺吸附分離原理是通過分子中酰胺基的羰基與酚類化合物中的羥基形成氫鍵而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離，特別適合多元酚類化合物的分離[26]。而且聚酰胺對鞣質具有極強的幾乎不可逆的吸附作用，滿足本實驗中除鞣質的需求（沒食子酸、鞣花酸、MEAG不具有顯著5α-還原酶抑制活性），從而使活性成分得到有效富集。因此聚酰胺色譜法較硅膠色譜法更適合分離強極性的酚酸類混合物體系。

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