網絡方法在食品體內功能定量化評價中的應用

龐廣昌，陳慶森，胡志和，解軍波，馬麗娜

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.天津商業大學理學院，天津 300134）

盡管對于食品的功能性問題，存在很多爭議，例如食品的功能主要應該是為機體提供生存和生命活動必須的營養，但是功能性食品及其功能研究還是越來越成為食品科學的重要研究領域，因為越來越多的研究結果表明：食品決不僅僅為機體提供生存所必需的營養，它同時也是機體學會如何適應周圍的物質世界并作出響應和適應的基礎。也就是說，食品不僅為機體提供物質和能量，更重要的是為機體提供信息。但是，在功能性食品的功能性研究中，我們遇到了幾個重大難題。1）雖然營養不足會造成相應的營養缺陷癥，但是當營養過剩時也會造成肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病甚至癌癥等現代文明病；這個問題不僅表明了食品科學，特別是功能性食品研究的重要性，同時也給我們提出了一個難題：不同個體、不同民族的飲食習慣、家庭背景、甚至不同的腸道微生物都對機體的營養需求產生不同作用。盡管針對這些問題的發展和蔓延，已經提出了個性化營養和試圖針對不同的個體基因組提供不同營養配方的營養基因組學研究思路，但是表觀遺傳學研究卻用大量的實驗結果告訴我們：一個人的飲食習慣和經歷也可以通過DNA印跡和組蛋白復雜的修飾作用，塑造和改變其表觀遺傳特性，而且可以傳代。這實際上相當于告訴我們：并非基因組決定我們的飲食需求，可能恰恰相反，飲食在不改變DNA序列的情況下決定基因組的表達、調控、修飾、記憶和遺傳，顯然這是對營養基因組學的致命性挑戰。于是問題又回到了原點：如何為不同的個體提供科學飲食和食品配方？2）食品和營養對免疫系統的作用是顯而易見的，也是功能性食品研究的熱門領域，但是近年來的大量研究表明，機體的營養似乎優先保證免疫防御系統的運行，只有在嬰幼兒、老年人、疾病狀態或營養嚴重缺陷時才會出現免疫力低下。換言之，在營養充分，甚至普遍過剩的今天，往往表現出免疫過強并由此導致炎癥、自身免疫性疾病和代謝綜合征。所以免疫學研究成果一再告誡我們：免疫是一把雙刃劍，免疫力低下會導致反復感染，但是免疫力過強會導致炎癥、超敏反應等自身免疫性疾病。問題是什么是適當的免疫？如何定量化功能性食品對免疫的作用？盡管已經積累了大量有關食品的免疫調節作用，包括食品對細胞因子的作用，但是由于至今沒有一個適合于免疫這一復雜系統的定量化方法，即使得到一些實驗結果，也難以提供一個確切的指導意見和結論，甚至往往互相矛盾、含糊其詞地得出一個幾乎放之四海而皆準的結論：“具有重要的免疫調節作用”。這些結論除了能夠發表文章以外，難以得出指導性意見，甚至誤導消費者。3）實驗方法上的突出問題是：我們往往沿用醫藥領域對藥物的實驗和藥效評價方法，亦即用離體實驗或實驗動物致病模型來對食品的功能進行評價，這實際上犯了一個簡單的邏輯錯誤，因為食品不是用來治病，而是用來維護機體健康和預防疾病。我國明文規定：保健食品不可標記治療作用。而且，對于這些離體實驗和病理模型動物所得出的實驗結果我們可以相信嗎？因為人畢竟不同于動物。理由很簡單，不同食性的動物食用同樣的食品其后果也不同，就像牛羊可以吃草，而人類不能吃草一樣。之所以用實驗動物做食品的功能實驗，主要是因為有些人一直認為：食品對機體的健康保護（治療）作用需要通過對相應組織或器官進行測定才能對其保護（治療）作用進行評價。既然需要取組織甚至器官，當然不能通過人，只能通過動物。顯然，要想用人對食品的功能進行評價，就必須解決無損檢測這一難題。4）食品只能通過胃腸道消化后才能吸收，不能吸收的就要排出體外。食品究竟是如何對機體內的器官或組織發揮生物功能？至少需要弄清楚：是通過直接進入機體達到靶器官或組織，還是通過作用于機體的胃腸黏膜系統，從而影響免疫、代謝、內分泌系統？已經有大量研究結果證明：食品和營養主要是通過和胃腸黏膜系統的相互作用，繼而通過胃腸道和機體內的循環系統和信號系統在器官和組織之間建立通信并發揮功能，而不是直接進入靶器官或靶組織發揮作用。但是，如何對這一復雜的非線性系統進行定量化描述就成了不得不面對的一個重大難題。本文將針對這些問題，在綜合國內外相關研究進展，特別是作者課題組近10年的研究成果的基礎上提供一個綜述和解決方案。

1 功能性食品及其主要作用機制

由于近年來現代文明病的流行和泛濫，促使很多科學家，特別是細胞和分子生物學領域的科學家對食品、營養和飲食健康問題產生了極大的興趣，特別是在飲食對胃腸系統微生態的作用、營養吸收與控制的信號途徑、非營養成分——植物化合物（phytochemicals）受體及其信號傳遞、胃腸道對神經內分泌系統的作用、胃腸黏膜免疫及其作用機制等方面進行了大量的研究，并取得了舉世矚目的成就。

1.1 胃腸系統的信號傳遞及神經傳導功能

大量研究結果證明，胃腸道系統可以通過植物神經和腦神經中樞緊密聯系在一起，并發現很多神經系統的疾病與飲食密切相關。大腦通過食欲控制進食的機制已經積累了大量研究成果，并說明大腦對飲食和營養的傳感作用除食物的顏色是直接通過光學信號傳遞以外，嗅覺、味覺和飽腹感信號傳遞都是通過受體和食物中的嗅覺成分、味覺成分和營養與非營養成分的相互識別，經過這些弱相互作用信號在細胞內的級聯放大作用，改變細胞的鈣離子通道、鈉鉀泵活性，從而通過傳感細胞釋放定量的電化學信號，刺激附近的神經末梢，進而將復雜的嗅覺、味覺、營養和非營養信號傳遞到大腦，通過大腦控制食欲和進食過程[1]。已知這些受體中最重要的受體家族就是G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs），它們因為都是通過其胞內結構域和G蛋白信號的級聯放大和傳遞途徑相偶聯而得名。G蛋白信號放大系統和糖代謝、脂代謝、蛋白質代謝等多條代謝途徑交互作用，控制著機體的神經、內分泌、免疫和生理代謝等幾乎所有生物功能。已知GPCRs是1個有上千個基因成員組成的超家族，不僅分布在視覺、嗅覺、味覺器官或組織，而且也分布在胃腸道系統、白細胞和循環系統，控制幾乎所有真核生物的營養吸收、免疫、代謝和內分泌活性[2]。

1.2 營養吸收及其調節機制

人類要生存，就必須滿足機體的營養需求。從進化的角度看，最原始的多細胞動物——腔腸動物，必須能夠傳感周圍物質世界的結構和功能，確定是否可以吸收這些營養作為它們的碳源和氮源，以便依賴新陳代謝而生存。它們沒有發達的大腦，也沒有復雜的神經系統，但是它們可以準確傳感周圍可利用的營養，特別是脂肪、葡萄糖和氨基酸等基本營養成分。近10年期間，已經獲得并鑒定了多種腸上皮細胞受體和傳遞體介導這些信號的傳遞，并進一步證明營養傳感并不僅僅發生在舌和鼻咽部，而是整個胃腸系統。胃腸道似乎可以使用復雜而精致的受體系統來區分食物糜中不同成分的特性和濃度。而且這些傳感受體沿胃腸道分布，對攝取的食品做出定量化響應。雖然有大量的GPCRs參與胃腸道（gastrointestinal，GI）對食品的吸收與“偵察”，但是對單獨營養的傳感可以激活多種互相交叉的信號途徑。而且，一個細胞上存在多種受體，激活細胞內不同的信號途徑，例如：多種受體都可以激活G蛋白信號級聯放大系統。可見機體可能正是通過這些復雜的受體和配體（基）之間的弱相互作用激活傳感細胞內的結構域，并通過信號途徑之間的“交談”實現輸出信號的定量化。已知GPCRs在糖、氨基酸、脂肪、氯化鈉等營養的傳感、吸收和定量化和食欲控制中發揮重要作用。正是GPCRs在味覺，特別是嗅覺信號傳感中極大的多樣性構成了生物各自不同的獲取營養的方式和渠道，占據不同生態位。

1.3 非營養成分的作用途徑

近年來，來自飲食的植物化合物（phytochemicals，PhC）對健康的保護作用得到了學術界的高度重視。人們早就注意到，來自果蔬等植物的這些化合物雖然不是經典意義上的糖、脂肪和氨基酸等“大營養”，其健康作用則不容忽視。而且，已經證明它們在健康保護、抗癌、防癌，特別是預防現代文明病方面表現出巨大的應用潛力。研究發現，它們主要通過和受體相互作用向機體、組織和細胞傳遞信號。PhC涉及的受體主要是：Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、GPCRs和雌激素受體（estrogen receptors，ERs），其中雌激素受體屬于核受體，包括：脂調節過氧化物酶體增殖因子激活受體（lipid-regulating peroxisome proliferatoractivated receptors，PPARs）、肝臟X受體（the liver X receptor）、法呢醇X受體（farnesoid X receptor）和孕甾烷核受體（the pregnane nuclear receptor，PXR）；所涉及的信號途徑主要有：磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）、絲裂原-活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）；所涉及的轉錄因子主要包括：Nrf2、活化因子蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）等[3]。不同信號途徑之間互相“交談”從而構成了非常復雜的信號調控網絡。機體復雜的生命活動，特別是免疫和防御活動依賴于體溫升高、代謝增強，特別是中心代謝途徑所涉及的酶活性的協調增強，從而為細胞和機體提供能量。與此同時，不可避免地造成對自身的傷害，也就是過頭的免疫應答，這可能也正是現代文明病的重要病因。值得注意的是，幾乎所有PhC都表現出抑制炎癥，下調先天免疫、獲得性免疫、分解代謝和內分泌[4]。可見，當今維護人類健康的主體是下調免疫，而不是增強免疫。

1.4 腸道微生態的復雜作用及其調節機體健康的途徑

近年來，腸道微生物、益生元（prebiotics）和微生態研究取得了舉世矚目的成就。已經證明，腸道菌群的構成在宿主健康和生命活動中發揮重要作用。2012年，科學雜志就腸道微生物和健康的關系發表了系列綜述，從生態學、基因組學、代謝組學、免疫學和大眾健康等多角度綜述了腸道微生物與健康和疾病的關系[5]。Costello等[6]著重強調了腸道微生物的種類和多樣性及其與腸黏膜系統的互作，以便更清晰地了解腸共生動力學和生態理論，了解飲食習慣與微生態變化和穩定性的關系。Lemon[7]則重點考察了抗生素治療所造成的微生態破壞，以及如何通過益生元進行修復的問題。Nicholson等[8]提出，腸道微生物也是宿主代謝系統的參與者，它們受飲食中營養的影響，反過來又影響機體的代謝網絡。Haiser等[9]綜述了腸道微生物對醫藥和食品在代謝上的相互作用和影響。Hooper等[10]則重點討論了腸道微生物與宿主免疫的關系，以及腸道微生物對保持腸道內平衡的作用。不論從哪個方面看，腸道微生物菌群和宿主之間在代謝、生理、內平衡和免疫相互作用都是復雜的，非線性的。例如：到底是飲食結構塑造了腸道微生物，還是腸道微生物塑造了宿主的微生態？顯然可能都有作用。因為飲食結構顯然是腸道微生物的重要培養基，而腸道微生物和宿主共同形成的代謝組又對機體營養吸收與代謝平衡發揮重要作用。需要想強調的是：宿主的免疫系統對腸道微生物菌群的作用也是不可忽視的，因為炎癥反應的發起者是宿主而不是腸道微生物。

遺憾的是，面對如此復雜的系統，除微生物種群和遺傳多樣性以外，至今還沒有一個定量化的方法來描述微生物和宿主在代謝、免疫、生理、內分泌等復雜相互作用。原因是面對如此復雜的非線性系統，我們似乎束手無策。幸運的是，如果翻過來分析：無論微生物在腸道中和食物以及宿主發生多么復雜的相互作用，必需通過作用于宿主體內的神經、代謝、免疫和內分泌才能發揮作用，那么，只要能夠對飲食所產生的結果，建立機體內細胞間無線通訊網絡作用的定量化模型就能解決這一難題。

2 神經內分泌生理代謝調節的復雜性和非線性問題

越來越多的研究結果表明，食品——特別是功能性食品對機體神經內分泌和生理代謝有明顯的影響，這也正是把免疫失調、慢性炎癥、糖尿病、高血脂、肥胖、糖尿病等歸納為生活方式癥的原因所在。厭食、暴飲暴食、抑郁、狂躁、孤獨等疾病也被公認飲食不當或食欲控制失調所造成的疾病。慢性結腸炎、克隆氏病和老年癡呆也與飲食有密切關系。已有調查和研究結果表明，上述病人往往伴隨著細胞因子異常、激素和內分泌失調等癥狀發生。但是，由于其作用過程、途徑、分子機制、代謝復雜性及其相互作用，構成了一個非線性復雜體系，至今難以建立定量化研究方法和數學模型。

2.1 免疫和細胞因子網絡的交互作用控制復雜的免疫防御系統

口服疫苗的成功提示我們，腸道可能是最重要的天然免疫接種系統。特別是腸道上的微皺折細胞（M細胞）介導可以完整抗原進入PP結（peyer’s patches）；樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）作為取樣細胞負責提取腸道內腔中的抗原，并進行處理，自身轉變為成熟細胞，遷移進入引流淋巴結；腸上皮下的抗原遞呈細胞（antigen presenting cells，APC）則負責處理并提呈抗原決定簇給原態Th0細胞，從而構成機體免疫識別腸腔中食物和微生物的分子基礎[11]。病原體模式識別受體-TLRs則通過識別食物中的病原體模式分子激活或抑制炎癥細胞因子，如白細胞介素（IL-1、IL-6）、干擾素（IFN-δ）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的釋放，這些炎癥細胞因子既是激活先天免疫的前提條件，又是產生獲得性免疫的必經途徑[12]。

2.2 細胞因子和激素共同控制復雜的代謝內分泌系統

毫無疑問，生命活動需要能量，而能量則以分解代謝、氧化磷酸化為基礎。不難想象：所有生命活動，特別是以白細胞為基礎的免疫防御系統的運行都需要能量供應，需要分解代謝。但是代謝是一個復雜的網絡，由多種酶催化和協調控制。其中任何一種酶都不可能控制整個網絡的協調增強或減弱。什么條件可以保證整個代謝網絡協調改變？當然只有溫度，也就是體溫這一重要的狀態函數。所以免疫防御系統的激活和抑制必然伴隨分解代謝的增強或減弱、體溫的升高和降低、以及分解代謝、呼吸和氧化磷酸化的上調或下調。本質上這些正常生命活動調節的基礎顯然依賴于飲食和胃腸道營養吸收及其與食物的相互作用。胃腸黏膜系統不僅是機體選擇性控制和吸收營養的場所、免疫調節和黏膜免疫屏障基礎，而且也是機體最大的免疫及內分泌系統。近年來的大量研究證據表明：胃腸系統擁有最大的淋巴系統——腸相關淋巴組織和內分泌系統——胃腸激素分泌系統。在胃腸黏膜系統和各個重要器官之間存在著密切的通信聯系[13]。

胃腸系統的食物、微生物通過和胃腸黏膜受體之間復雜（直接或間接）的相互作用向機體內發送信號：細胞因子、趨化因子和激素（各種腸激素），這些信號分子通過循環系統傳遞到各器官、組織或細胞，它們在接到信號后還可以再發出相同或不同的信號傳遞給其他細胞，從而形成一個由自分泌、旁分泌和內分泌構成的局域或全局性的細胞通訊網絡。胃腸黏膜系統至少有400 m2的面積，不僅是機體最大的防御系統，也是最大的信息、物質（營養）和能量交流系統。它以分泌細胞因子、趨化因子和激素作為通訊的信號分子，通過循環系統實現機體內細胞間無線通訊網絡。同時該網絡控制和調節機體的神經、生理、免疫、內分泌和代謝網絡。

激素對代謝內分泌系統的控制已經得到了充分的研究和證實，細胞因子除了控制先天免疫、獲得性免疫、免疫平衡外，對代謝也發揮非常重要的控制作用。一個重要的問題是：為什么機體的免疫防御作用總是和炎癥、體溫升高相伴？這個問題從能量的角度進行分析就變得很清晰：免疫防御作用需要大量的能量來保證其生物活性，特別是白細胞的動員、趨化到達靶位點（部位）及其對靶細胞的殺傷作用。這一切都需要能量的不斷補給和保證。而細胞的能量當然來自代謝，特別是分解代謝和氧化磷酸化。動員機體的能源物質（肝糖原、肌糖原）需要內分泌系統的配合，同時需要經過相應代謝網絡中所有酶活性的協調提高。能使分解代謝中所有酶的活性同時提高的只有體溫。所以機體的免疫，特別是先天免疫應答過程一定伴隨著體溫的升高和分解代謝的增強。除此之外，機體本身的能量貯存也對分解代謝控制發揮重要作用：當能量（主要以脂肪的形式貯藏在皮下，特別是腹部）儲存超過一定的界限時，機體也會隨時拉響（由mTOR所發動）“需要增強能量消費”的警報。可見肥胖、糖尿病、高血脂甚至癌癥等現代代謝綜合征的原因也正是機體調節能量儲存和消費的一種應激機制[14]。有趣的是，當機體接收到病原體入侵信號時就會激活機體的炎癥反應，升高體溫，激活免疫防御系統，但是，為了防止炎癥反應所帶來的自身損傷，同時也啟動抗炎癥信號，其作用在于：一方面可以將炎癥反應嚴格控制在安全范圍內；另一方面，一旦完成了免疫防御作用可以隨時關閉炎癥反應，如圖1所示。這些細胞因子、趨化因子和激素在機體中通過自分泌、旁分泌和內分泌形成一個復雜的網絡，表現為極端的復雜的非線性，盡管定量化測定這些作用非常迫切，但是至今沒有一個能夠真正實現定量化描述的數學模型。

圖1 炎癥和抗炎癥平衡調節Fig.1 The balance between inflammatory and anti-inflammatory reactions

病原體所誘發的信號途徑通過對IκB的磷酸化和泛素化解除其對NF-κB的控制，起動NF-κB轉入細胞核，轉錄炎癥細胞因子，促使機體通過發炎，亦即提高體溫激活免疫防御系統，發揮免疫應答和防御作用，但是與此同時NF-κB也會促進IκB的轉錄與表達，除非有持續的入侵信號刺激IκB的降解，否則新合成的IκB就會通過將NF-κB扣押在胞漿中，不再啟動炎癥細胞因子的轉錄和表達。除此之外，還有：SOCS、IL-10和TGF等多種機制控制炎癥細胞因子的表達，防止過頭的炎癥反應。

3 網絡和網絡方法在生物學領域異軍突起

網絡研究方法的應用在幾乎整個生命科學領域中產生了一場革命。生物大分子（DNA、RNA、蛋白質，如轉錄因子）之間互作網絡的研究結果已經改變了生命科學諸多領域，特別是分子生物學領域的各個方面，如：科學家的思維方式、技術路線和研究思路[15-16]。盡管已經在Nature、Science和Cell等頂尖雜志上不斷發表研究和綜述性論文，盡管在多種模式生物，特別是酵母菌中進行了全局性分子互作網絡的研究，并得出若干幾乎可以顛覆性的結論，但是生命活動的基本單位并不是這些大分子本身，而是細胞[17]。所有的生物活性分子都必需通過細胞發揮其生物學功能。遺憾的是，雖然科學家早就意識到高等動物除存在一個以腦為中心的神經網絡，它控制著機體的運動和神經活動以外，一定還存在著一個控制代謝、內分泌和免疫防御系統的無線通信網絡，但是到目前為止對這些網絡的研究還處于一般的文字表述水平。

根據來自動物、植物和微生物的大量代謝研究結果，已經繪制出細胞的代謝網絡。但是這張代謝網絡圖只是根據化學結構、酶、化學平衡和自由能等參數推測而來，并非體內或細胞內的真實情況。最先通過網絡和化學劑量學方法對代謝網絡進行研究的是生物化工領域，主要目的是通過對代謝網絡進行通量及其控制分析獲得更大產量的代謝產物。但是隨著研究的不斷深入，發現在通過模式微生物，如大腸桿菌進行代謝網絡的通量控制分析時，并不像生物化學家所預料的那樣存在著限速步驟和限速酶。這實際上已經宣布：很多生物化學和分子生物學推測在現實中并不存在。當我們要了解體內代謝網絡及其控制時，必需重新進行實際檢測。隨基因操作、基因芯片等高通量檢測技術、核磁共振技術等的不斷發展與應用，代謝網絡研究取得了舉世矚目的進展[18]，從網絡理論來看，細胞中蛋白之間相互作用，代謝相互作用、信號相互作用和轉錄相互作用可以構成網絡，這些網絡的相互作用形成“網中之網”（network of networks），這些網中之網負責機體、器官、組織和細胞的行為。網絡生物學的主要任務是要集成理論和實驗來繪制出這些網絡，從而以定量的形式搞清楚生命活動的動力學和拓撲學特性。

近來，一種半自動的酵母菌雙雜交篩選生物芯片技術（stemi-autmated yeast two-hybrid screens）[19]和生物分子互作的SPR技術可以使科學家測定生物大分子是何時并如何相互作用的。這些研究已經揭示出細胞內分子互作網的建筑學特性就如同互聯網、計算機芯片和社會網絡。Jeong等[20]利用SAYTHS技術研究了43種生物的細胞代謝網絡得出：1）它們都是無標度（scale-free）的、強健的和容錯（error-tolerant）的，也就是抗干擾的網絡。2）具有小世界（small-world）特性，任何兩個節點都可以有少量的代謝反應（連接點）與其連接。3）高度連接的是底物而很少連接的則是種屬特異性酶的產物[20]。4）生物網絡都是統計異質的，也就是說不同的節點由不同的連接數k，復合倍數定律分布（the power-law distribution（P（k）≈kγ）），在這樣的網中，新的節點偏向于和已經連接了節點的節點連接。此種網即強健又具有抗出錯能力。5）所有已測定的43種生物的代謝網絡的結構和規模都是一樣的。6）所有已測定的生物的平均連接數目（兩個節點之間的連接數目）都意外地相近，在3左右。7）如果一種底物（節點）由于催化其反應的酶的突變而突然降低，則很快就可能有一條最短的生化代謝途徑和少數新酶的表達，通過更大的網絡半徑來補救，這顯然相似于互聯網中的TCP/IP協議。8）大腸桿菌代謝網絡計算機模擬和在體突變（in silico and in vivo mutagenesis）研究表明，細胞可以耐受若干代謝酶的刪除。9）擁有最多連接的節點也就是“hubs”在所有已測生物中都是相同的。

蛋白質之間的互作網（protein-protein interaction network）研究表明[21-22]，無標度網有驚人的抗意外損傷的能力，即使80%的隨機選定的節點斷裂，保留的20%仍能形成互聯簇，使任何兩個節點間保持連接。當然，這一特征依賴于hubs。在酵母菌中，0～10%的蛋白質少于5個連接，大于60%的多于15個互連（互相作用），這表明蛋白的互連度在決定缺陷基因表型中具有重要作用，只有約18.7%的酵母基因（約14.4%的大腸桿菌基因）缺失使細胞致死。很多大腸桿菌的基因同時缺失甚至不會發生任何表型變化。證明很多基因在無標度網中是可以互相替代的。圖2為酵母菌蛋白互作網。

圖2 酵母菌蛋白互作網[[2233]]Fig.2 Yeast protein-protein interaction network[23]

該圖依據早期酵母雙雜交測定結果繪出[23]。該圖表明只有很少高連接的節點，也就是hubs。其中最大的簇含有所有蛋白的約78%。節點的色度表示移去相應蛋白之后的表現型[24]。已經測定到7 048種蛋白質之間具有相互作用，其互作評價也已經搞清楚。在蛋白互作網中，高度互作的蛋白占總互作蛋白（4 679）的66%。

各代謝途徑中基因的相關性和互作也有大量的研究報道[25]，圖3顯示出了基因互作和代謝途徑的關系。

Ihmels等[26]根據自己和他人的資料進行了層次模塊分析，其結果見圖4。細胞網絡的這些研究成果促使科學家不得不從新的角度來看待生命科學研究。通過細胞網絡研究，人們可以應用各種分子生物學技術，數學、拓撲學、網絡知識從整體上，從生物分子的相互作用上觀察和研究生物及其基本生命活動單位——細胞。大量的研究結果顯示出，細胞內的生物網絡屬于無標度網（scalefree network）和分級網（hierarchical network），這種網絡具有很強的自穩定、抗干擾和進化能力。通過將細胞中的各種組分連接成網絡，我們可以研究細胞系統的自組織、自穩定、自調整和細胞的整體結構、功能和行為。細胞的生物網絡研究成果同時也對基因操作和生物工程提供了重要的理論依據。這提示我們：生物很少有單基因性狀，尤其是面對復雜非線性系統時，必需從系統和網絡的觀點來設計操作方案，重點要考慮影響系統穩定性的關鍵因素，如hubs。

圖3 同一代謝途徑中蛋白（酶）基因的相關性[[2266]]Fig.3 The correlations among protein (enzyme) genes of the same metabolic pathways[26]

圖4 代謝網絡的層次模塊[[2266]]Fig.4 The Hierarchical module of the metabolic network[26]

4 機體內細胞間無線通訊網絡的建立

筆者早在2006年[27-28]根據大多數功能性食品和藥物雖然不能進入體內，但可以發揮重要的生物學功能（最為典型的是可食性纖維）的事實和當時的國內外有關免疫學研究進展提出：食品或藥物主要是通過和胃腸黏膜系統的受體進行相互作用誘導機體產生細胞因子、趨化因子或激素，從而影響和改變機體的免疫和生理功能。本課題組通過大量實驗建立了相應的實驗方法，通過一系列實驗結果證明：食品——特別是功能性食品——的確是通過改變機體的細胞因子、趨化因子和激素發揮生物功能[29-37]。但是當我們面對進食功能性食品后，多種細胞因子都有顯著性變化的實驗結果時，也必須面對另一個問題：這些細胞因子的顯著變化到底意味著什么？有什么生物學意義？細胞因子、趨化因子和激素歷來是醫藥、生物化學及子生物學研究的熱門領域，幾乎每一種細胞因子都具有無數多種功能，但是這些功能都是在不同條件、不同場合下所發揮的，例如IL-6既具有促炎功能，也具有抗炎功能，還具有調節脂肪酸代謝的功能。如果僅僅是為了寫文章，似乎可以依照個人意愿和想象力列出其相應的功能，但是其真實作用和實際意義到底是什么我們卻不得而知或者說僅僅是推測和想象而已。

顯然，要解決這些問題，必需澄清一個重要的邏輯問題：生物功能的最小單位到底是細胞還是分子？或二者皆是？回答當然是細胞而不是分子。分子只能通過細胞發揮生物學作用。于是在此基礎上筆者所在的課題組針對酪蛋白酶解肽所產生的顯著性變化的細胞因子通過當時的數據庫檢索出分泌這些細胞因子的細胞和這些細胞因子作用的靶細胞，并通過這兩個矩陣的運算建立起由這些細胞因子所形成的機體內細胞間無線通訊網絡的變化情況[38-39]。這是一個有向加權網絡，也是機體內天然存在的細胞間無線通訊網絡。它和由神經纖維所構成的神經網絡不同，神經網絡實質上屬于有線連通網絡，只能形成以腦為中心，和固定的組織、器官之間的神經纖維通訊，傳遞的是電信號（神經興奮），速度快，但是不能實現移動細胞（例如血液中的紅細胞、白細胞）、組織和器官之間的通信。無線通訊網絡的通信介質，亦即信號分子是細胞因子、趨化因子和激素，其傳播動力是循環系統，發送信號依賴于信號分子的合成與分泌，接收信號依賴于細胞表面的受體，放大信號則要靠細胞內的信號級聯放大系統。值得強調的是，該網絡不僅可以實現器官、組織和固定細胞之間的通訊，而且可以實現移動細胞之間，以及移動細胞和固定細胞之間的通訊[40]。其實這個無線通訊網絡并不陌生，通常所說的細胞因子網絡本質上就是由信號發起者細胞合成與分泌細胞因子，經過循環系統運送到帶有其特異性受體的靶細胞所構成的細胞間的通訊網絡。實際上細胞因子在發送過程中并沒有分子間的相互作用，細胞因子本身不可能構成網絡。最早對這個以細胞因子作為信號分子所形成的細胞通訊網絡進行建模和分析的是Frankenstein等[41]，通過對細胞因子的數據庫進行收集與分析，建立起一個復雜的細胞通訊網絡。同時還比較了當時所公布的100個不同的網絡研究結果，發現免疫細胞之間通過細胞因子所構成的通信網絡的密度最高，達0.61，比猴腦的神經網絡密度0.15高得多。排在第二位的是免疫細胞和非免疫細胞之間通過細胞因子所構成的通訊網絡，密度為：0.40。

5 機體中代謝網絡及其研究方法

代謝網絡及其通量控制分析主要在模式生物，如酵母菌中進行，這是因為需要通過基因操作才能實現代謝途徑中不同酶的定量化表達與合成，從而得出各自對通量的控制作用（通量控制系數），而要得到足夠多有關代謝途徑中酶的不同表達并進行通量控制分析幾乎是不可能的，因為催化代謝，特別是中心代謝途徑的酶的突變體往往是致死性的或者由于其調節酶特性和容錯能力造成表型上的無反應。而且通量控制分析需要在穩態的條件下進行，顯然這是通量控制分析主要停留在模式生物的主要原因。筆者發現：只要改變細胞或動、植物機體的環境溫度，就可以將代謝網絡中所有酶的合成量變成變量，再通過其對通量（變量）的數學處理，即可以進行代謝網絡的通量控制分析。課題組從2003年開始進行代謝網絡，特別是中心代謝途徑的通量及其控制分析研究，已經先后對水稻、瑞士乳桿菌、螺旋藻、蟾蜍、黃鼠、人類、哈密瓜進行了代謝網絡的通量控制分析[42-44]，并充分證明了通過通量及其控制方法對食品的體內作用進行評價的可行性。在此基礎上，課題組通過志愿者分析了食用不同溫、涼、寒、熱、平屬性的食品所引起的體內乳酸代謝的通量變化，發現：乳酸通量可以作為機體分解代謝和氧化磷酸化的一個重要指標，凡熱性食品都會增加其通量，而涼、寒性食品則降低乳酸通量（尚未發表的材料）。因此，通過代謝網絡的通量及其控制分析可以定量化描述食品對體內分解和合成代謝的控制作用。顯然這在普遍存在營養過剩和生活方式病的今天具有非常重要的研究意義和應用價值。有趣的是，由代謝及其通量所構成的網絡與上述機體內細胞間無線通訊網絡一樣也屬于有向加權網絡[45]，可見有向加權網絡可能正是生命活動的主體和主旋律。

6 有向加權網絡模型為復雜非線性問題提供了一系列定量化方法

雖然有關腦神經網絡的研究由來已久，但是網絡研究真正成為研究熱點則是由于互聯網絡的建立、完善和推廣應用。通過網絡不僅把地球變成了一個實際上的“地球村”，而且網絡實質上已經成為一門數學，一種哲學和一種新的思維、推理方法，網絡方法和系統方法已經應用于通信、信息、生物、生態、社會、經濟和政治等各個領域。特別是網絡方法可以為復雜非線性系統提供多角度的量化方法。

在生命科學領域，現有的研究工作主要是通過構建無向無權網絡，如：代謝網絡[46-47]、蛋白互作網絡[48-49]、蛋白結構免疫球蛋白網絡[50]和有向無權網絡，如：神經網絡，模擬和分析生物復雜系統的發展和演化規律。然而，在生物學各領域中普遍存在的卻是有向加權網絡，例如代謝網絡、群體之間所形成的食物鏈、微生態系統所形成的群絡等。很少有研究同時考慮權重和方向（即基于有向加權網絡開展研究），原因之一就是已有數據不支持構建有向加權網絡來模擬和分析生物復雜系統。

由于生物系統，往往面對的是多變量、非線性、復雜體系，所以其定量化問題始終是一個最大的難題。在食品和醫藥領域，雖然已經有很多離體研究成果，但是根本不可能用這些成果進行精確的體內作用推測，因為體內是一個非常復雜的多變量非線性體系。面對這一復雜的非線性系統，盡管包括數學家在內的科學家已經進行過不懈的努力，但是至今并沒有一個公認的量化方法。只有網絡方法給我們展示了廣闊的解決這些難題的希望。

雖然對于有向加權網絡已經有一些文章發表，但是總體上還處于初級階段。筆者所在的課題組最近提出了出度、入度、總度，出權重、入權重、總權重，出聚類系數、入聚類系數、總聚類系數和最短路徑等數學模型。特別是聚類系數，既考慮了節點之間相互作用的方向也考慮了相互作用的強度，是一個比較科學的定量化刻畫這種網絡的指標。有向加權網絡可以簡化為無向無權網絡，換言之，無向無權網實質上只是有向加權網絡的簡化形式（尚未發表的材料）。總之，網絡，特別是有向加權網絡方法可以從不同的角度為復雜的非線性系統提供一系列定量化參數。在食品或藥物的體內、外生物功能的定量化研究、動力學評價、胃腸道微生態、代謝等目前最重要的研究領域提供了新的定量化研究途徑和解決方案。

7 通過外周血可以實現食品功能的無損傷檢測

一個非常值得思考的問題是：為什么食品功能不能通過人而只能通過動物實驗來檢測？顯然，人和人之間對食品的功能都不一樣，何況人和動物？生態學家早就告訴我們，不同的動物占據不同的生態位，主要源于其取食方式，如捕食與被捕食的關系。而且，尚無任何一種動物和人具有相似的食性，更不要說相同的基因型。體外實驗所得出的結果和結論當然對人的參考價值非常有限。近年來，動物模型被大量用于功能性食品或功能因子的功能性評價，這些方法原封不動地照搬了醫藥學研究領域。但是我國明確規定：功能性食品不能標注治療作用，于是經過動物模型所做的實驗的實際意義是什么？是為了治病還是防病？可見在食品科學領域照搬醫藥學實驗方法從根本上是行不通的。食品的目的是為了獲取生存所需要的營養、維護機體健康，而不是為了治病。換言之，食品是所有人生存的基礎，而藥物則是治病。當然，另一個不可回避的問題是：功能性食品只有吸收到體內才能發揮功能嗎？事實上，幾乎所有的食品都必需經過胃腸系統的消化才能被吸收，蛋白質要消化成氨基酸或二肽、三肽；淀粉要消化為葡萄糖；脂肪要消化為脂肪酸和甘油；核酸要消化為核苷酸。不消化成和自身基本營養成分相同的物質就不能被吸收，特別是親水物質包括：鈉、鉀離子都不能隨便進入機體。為什么？因為機體必須保證自身的獨立性和穩定性。顯然，食品營養以外的功能，至少主體上并不是通過進入體內發揮作用，而是通過和胃腸道系統復雜的相互作用發揮功能，特別是可食性纖維、多糖、多肽和大多數水溶性成分，當然也包含腸道微生物及其代謝產物。這本來是經過大量實驗證明了事實，但是在食品功能性評價研究中卻經常被忽略。再一個問題是：對哪個臟器有作用，就需要摘取那個臟器進行功能評價嗎？例如，評價醋的護肝作用，就需要制造肝損傷模型，然后取肝臟進行評價？這顯然正是食品只能用實驗動物進行評價的重要原因。難道有心病的人真的只有把心掏出來化驗才能證明其心病是否存在嗎？奇怪的是，這種簡單的邏輯錯誤在國內外食品科學領域的論文里大量地存在甚至發展。機體是一個由腦神經網絡和循環系統作為信號傳遞系統的體內細胞間無線通信網絡所構成，在臟器之間，例如胃腸道系統和其他器官、組織和細胞之間傳遞信號，根本不需要任何外來成分的參與，通過細胞因子、趨化因子和激素可以傳遞任何信息包括發育、分化、功能調節、代謝調節、生理調節等。換言之，通過循環系統中這些信號分子的測定，理論上可以獲得所有生物功能和生理信息。而所有這些信號分子的測定已經積累了海量的研究數據和高通量的測定方法。更值得一提的是：這些信號分子的測定只需要2～3 mL外周血，也就是說：基本上屬于無損傷檢測。最后一個問題是：以往的大多數功能性食品評價實驗往往需要至少3～4周的動物實驗（例如小鼠實驗），而小鼠的壽命只有2年左右，4周相當于小鼠壽命的1/24，相當于人的3～4年。功能性食品真的需要吃那么長的時間才能發揮作用嗎？如此長時間食用同一種功能性成分很可能造成機體的耐受性，或偏性。為了弄清楚食品發揮作用的規律，本課題組已經進行過系統研究，結果證明：食品發揮最大功能的時間是在食用后2.5～3.0 h，而且最適當的檢測時間是下午的2點半到3點。為了最大限度地避免基因型和遺傳背景所造成的誤差，人們往往選擇純系小鼠作為實驗動物，但是這卻很難適用于食品功能評價，因為沒有哪一種動物和人的基因型完全吻合。只要不再認定護肝作用只能摘取肝臟來進行評價，只要能夠通過采集少量的外周血就能夠建立起機體內細胞間的無線通信網絡，就可以通過志愿者進行真正意義上的食品功能評價。而且完全可以通過同一個人食用不同的食品來進行評價，這樣可以有效避免基因型所造成的偏差。

8 結 語

科學家夢寐以求，要解決復雜非線性系統的定量化問題，但這一直是傳統數學的極大挑戰。腦神經網絡、互聯網絡的發展不僅改變了整個科學，也改變了人們的生活方式甚至思維方法。網絡方法已經成為一種數學和哲學方法，為復雜非線性系統的定量化提供了一套近乎完美的科學方法。網絡方法已經被大量用來研究DNA、RNA、蛋白等分子互作，取得了大量成果，大大改變了該領域前沿科學家的認識和思維方式，甚至正在引發分子生物學領域的革命。在代謝領域，通過代謝網絡的研究，可以大大減少代謝組學所面對的變量上極大的復雜性和多樣性，在生物化工和生物技術領域則已經產生了巨大影響和廣泛應用。功能性食品的功能性評價是一個充滿爭議和挑戰的領域，筆者所在的課題組經過多年努力，已經建立了一套適合于食品和藥物體內功能評價的方法：體內細胞間無線通信網絡評價方法。由于該網絡屬于有向加權網絡，所以可以參考生物大分子互作網絡——無向無權網絡模型和有向加權代謝網絡模型，引入多種參數，可以從多個不同角度定量刻畫這種網絡。食品和營養代謝密切相關，筆者所在的課題組已經成功創建了適合于研究人機體內中心代謝途徑的通量和通量控制分析方法，可以定量化研究食品對機體內合成與分解代謝的作用，從而為食品對機體合成與分解代謝的功能評價提供了一個定量化研究方法。值得注意的是圍繞中心代謝途徑所形成的代謝網絡同樣可以將通量轉化為加權值，反應方向作為有向性，從而將代謝網絡轉變為有向加權網，用有向加權網絡模型進行定量化描述。由于這兩種網絡全部是通過采集適量的外周血進行測定，近乎無損傷檢測，從而為實現功能性食品的定量化功能性評價提供一種新的近乎無損檢測的定數量化方法。

到目前為止的大部分食品營養和功能評價是通過實驗動物作出的，還有一部分是離體實驗結果，對人類本身的功能評價卻很少，多數來自調查。所以一系列適合于人類食品營養及其功能評價方法的建立、完善和推廣具有極其重要的意義，相信上述體內細胞無線通訊網絡和代謝通量控制網絡模型的建立與完善在食品或醫藥的體內功能評價方面必將發揮舉足輕重的作用。除此之外，有向加權網絡是無向無權網絡的擴展形式，具有更普遍的意義和適用范圍。腸道微生態系統、果蔬表面微生態系統、動物、植物和微生物生態系統、捕食與被捕食者以及社會上人和人之間的關系實際上都可以構成有向加權網絡，該網絡模型為復雜非線性體系提供了一個從不同的角度進行定量化刻畫的解決方案，具有廣闊的應用前景。

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