雙歧桿菌優良菌株的篩選及耐消化道逆環境性能

熊 濤，黃巧芬，杜 曼

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

雙歧桿菌優良菌株的篩選及耐消化道逆環境性能

熊 濤，黃巧芬，杜 曼

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

以改良MRS培養基作為選擇性培養基，初篩得75 株嚴格厭氧且菌落呈藍色的雙歧桿菌疑似菌株。在pH3.0和含3.0 mg/mL膽鹽的改良MRS培養基中培養20 h，得到吸光度較高的11 株，并選出耐酸耐膽鹽較好的NCU712、NCU701、NCU708進行生理生化鑒定，NCU712基本符合長雙歧桿菌的特征。經16S rDNA分子生物學鑒定菌株NCU712為長雙歧桿菌。并在模擬人體消化道逆環境下對菌株NCU712的耐受力進行初步研究。結果表明：在pH 3.5以上的人工胃液中，NCU712活菌數隨著作用時間的延長而略有上升；pH 2.5時菌株NCU712的D值為30.42 min；pH 3.0時D值為92.97 min，作用2.5 h活菌數保持在107CFU/mL以上；人工腸液作用4.0 h后，活菌數保持在108CFU/mL以上；3.0 mg/mL膽鹽中培養24 h后，活菌數下降1（lg（CFU/mL））。說明NCU712對人體胃腸道耐受性良好。

雙歧桿菌；篩選鑒定；消化道逆環境；耐受能力

雙歧桿菌是人體腸道正常菌群，具有促進消化吸收[1]、通便、生物拮抗作用[2]、護肝、提高免疫力和抗癌[3]等功能。通常人體腸道內主要有嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和長雙歧桿菌。雙歧桿菌作為典型的專性厭氧菌，常用亨蓋特滾管、厭氧罐、厭氧袋及厭氧箱4 種厭氧技術培養，選擇性培養基主要有LP、 MRS、TPY、PTGY、改良MRS等，改良MRS應用較廣泛，且添加5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal）顯色劑可初步分辨雙歧桿菌和其他乳酸菌。益生菌在腸道定殖的前提是人體消化道逆環境有良好的耐受性，不同雙歧桿菌的耐受力不同[4-6]。實驗分別從健康新生兒糞便和成人糞便篩選出對酸和牛膽鹽具有較好耐受性的菌株，進行生理生化、分子生物學鑒定，并探討其在模擬胃腸道環境中的存活能力，為該菌株的后期功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新生兒糞便來源于出生19 d的母乳喂養兒童；健康成人糞便來源于24 周歲健康女性。

1.2 培養基及緩沖液

改良MRS培養基[7]（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏4.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸三銨2.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.05，吐溫-80 1.0 mL/L。

初篩培養基：在改良MRS培養基中添加20 g/100 mL瓊脂和60 mg/mL X-Gal。

復篩培養基：pH 3.0改良MRS培養基；3.0 mg/mL膽鹽的改良MRS培養基。

蛋白胨緩沖水溶液（g/L）：蛋白胨10、磷酸氫二鈉2、葡萄糖5、磷酸氫二鉀2、氯化鈉5。

1.3 試劑

人工胃液[8-9]：準確取0.1 g/mL的鹽酸16.4 mL，稀釋，調節pH值分別達到2.5、3.0、3.5、4.0。分別加入胃蛋白酶終質量濃度為1 g/100 mL，充分溶解后，用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，備用。

人工腸液：稱取KH2PO43.4 g，加250 mL蒸餾水溶解，用0.4 g/100 mL NaOH溶液調節至pH 6.8，稀釋至500 mL，加入胰蛋白酶終質量濃度為1 g/100 mL，充分溶解后，用孔徑0.20 μm微孔濾膜過濾除菌，備用。

1.4 儀器與設備

YQX-Ⅱ厭氧培養箱 浙江義烏冷凍機總廠；YXQLS-50/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠；紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；顯微鏡 重慶光學儀器廠；pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 雙歧桿菌初篩

健康新生兒及成人糞便樣品收集后置于無菌離心管中，塞緊并放于裝有冰袋的盒子帶回，于改良MRS液體培養基富集后，梯度稀釋，涂布初篩培養基平板，厭氧培養48 h，挑取藍色菌落純化3 次。純化后的菌株進行厭氧需氧實驗，挑取嚴格厭氧菌30%甘油管保存。

1.5.2 耐酸耐膽鹽復篩[10-11]

甘油管保存的菌株接入液體培養基活化20 h后，按1%的接種量接種到pH 3.0的改良MRS培養基或3 mg/mL膽鹽的改良MRS培養基中，厭氧培養20 h，紫外分光光度計測定OD600nm值。

1.5.3 形態學及生理生化鑒定

挑取復篩后的菌株進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體顏色、大小、形狀等是否符合雙歧桿菌屬的基本形態特征。挑選革蘭氏陽性而且具有雙歧桿菌屬基本形態特征的菌株進行接觸酶實驗、明膠液化、吲哚實驗、糖發酵實驗、F6PPK實驗[12]。

1.5.4 分子生物學鑒定[13-14]

利用16S rDNA分子生物學特征鑒定。通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以待測菌基因組為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環；72 ℃后延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。序列的同源性在GenBank數據庫中使用BLAST工具進行比較，基于此序列，利用MEGA5.2軟件構建系統發育樹，確定待測菌的分類地位。

1.5.5 人工胃液耐受性實驗[15]

取1 mL活化后的種子液離心收集菌體，棄上清液，將菌泥轉到10 mL pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0的人工胃液中，混勻，37 ℃厭氧培養，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后取樣，梯度稀釋，進行平板計數。

1.5.6 人工腸液耐受性實驗[16]

取1 mL活化后的種子液離心收集菌體，棄上清液，將菌泥轉到10 mL人工腸液中，混勻，37 ℃厭氧培養，分別于0、1.0、2.0、3.0、4.0 h后取樣，梯度稀釋，進行平板計數。

1.5.7 耐膽鹽實驗

在改良MRS液體培養基中加入牛膽鹽（3.0 mg/mL），121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。冷卻至37 ℃以下備用，將活化后的種子液以1%的接種量接種到上述處理后的培養基中，37 ℃恒溫培養24 h后，進行平板計數。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌初篩

圖1 菌落形態Fig.1 Colonial morphology

圖2 菌株顯微鏡觀察（×1 000）Fig.2 Microscopic observation (× 1 000)

多數雙歧桿菌具有半乳糖苷酶且活性較好，在改良MRS培養基中添加底物X-Gal，半乳糖苷酶水解底物釋放出吲哚，雙歧桿菌菌落顯藍色，乳酸菌和其他細菌一般為白色或淺藍色，如圖1所示。純化3 次后，挑取嚴格厭氧菌進行鏡檢，如圖2所示，雙歧桿菌[2]是外觀變化很大的桿狀體，少許分叉成 Y、V類型，以及棍棒狀或匙狀類型，初篩得到75 株疑似雙歧桿菌。

2.2 耐酸耐膽鹽復篩

圖3 不同菌株在pH 3.0和3.0 mg/mL膽鹽的MRSC作用20 h的生長情況Fig.3 Absorbance values of different strains in pH 3.0 MRSC or MRSC with 3.0 mg/mL bile salt for 20 h

復篩后，獲得11 株耐酸耐膽鹽較好的菌株，如圖3所示，挑取NCU712、NCU701、NCU708進行生理生化鑒定（均來源于健康成人糞便）。

2.3 形態及生理生化鑒定

表1 部分生理生化鑒定結果Table 1 Some physiological and biochemical tests

根據表1、2、GB 4789.34—2012《食品微生物檢驗 雙歧桿菌的鑒定》及伯杰氏細菌鑒定手冊第8版，NCU712為基本符合長雙歧桿菌的生理生化特征，而NCU701與NCU708不能確定，故將3 株菌進行分子生物學鑒定。

表2 糖發酵實驗Table 2 Carbohydrate fermentation tests

2.4 分子生物學鑒定

圖4 菌株NCU712的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain NCU712

將菌株的16S rDNA基因序列分析測序結果在GenBank數據庫中使用BLAST工具進行比對，NCU701、NCU708、NCU712與長雙歧桿菌的同源性均達到98%以上，可確定3 株菌均為雙歧桿菌屬。且運用專業軟件MEGA5.2構建系統發育樹，如圖4所示，菌株NCU712與長雙歧桿菌屬于同一個分支，16S rDNA序列分析結果顯示與長雙歧桿菌的同源性最近，為99%。結合菌落形態、鏡檢觀察及生理生化實驗，鑒定菌株NCU712為長雙歧桿菌。

2.5 人工胃液耐受性

雙歧桿菌作為一種重要的益生菌，必須進入人體的胃腸道逆環境且達到一定濃度方可發揮益生功能。食物通過胃的時間一般是1～2.5 h，人體胃液pH值通常在3.0左右，隨著飲食變化而波動。這種酸性環境可激活胃蛋白酶原，從而殺滅隨食物進入胃內的細菌。故雙歧桿菌必須具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。長雙歧桿菌NCU712在不同pH值的人工胃液中的活菌數隨時間變化如圖5所示。

圖5 NCU712在不同pH值人工胃液作用不同時間的活菌數Fig.5 Changes in viable NCU712 count during inc ubation in artificial gastric fluid at different pH values

D值[17]表示在特定的環境下，殺滅90%微生物所需要的時間。由圖5可知，人工胃液pH 2.5時，D值為30.42 min；人工胃液pH 3.0時，D值為92.97 min。Li Jia等[6]的研究顯示4 種雙歧桿菌標準菌株在pH 3.0條件下，D值接近1.1 min，與之相比，NCU712耐酸能力強近百倍。且當人工胃液pH 3.5和4.0時，活菌數呈略微上升趨勢，可見此人工胃液pH值和胃蛋白酶已基本不影響NCU712的生長。

2.6 人工腸液耐受性

益生菌經胃進入腸道，小腸內存在大量、種類繁多的微生物，腸內環境pH值大約為7.6，含有胰蛋白酶及膽汁酸等對腸內菌群有影響的成分。因此益生菌對腸液必須具有一定耐受性，并保持106CFU/mL以上的活菌數，才能發揮益生作用。食物通過小腸的時間一般為1～4 h，由圖6可知，雙歧桿菌NCU712在人工腸液中活菌數隨作用時間延長而下降，D值為155.32 min，可見菌株NCU712耐胰蛋白酶的能力較強。

圖6 NCU712與人工腸液作用不同時間的活菌數Fig.6 Changes in viable NCU712 counts during incubation in artificial intestinal fluid

2.7 耐膽鹽實驗

腸液分泌的膽汁影響雙歧桿菌的存活，膽鹽會改變菌體外膜通透性，因此對菌體生長產生抑制作用，甚至殺滅菌體。牛膽汁與人膽汁效力相接近，故常用于模擬人體腸道膽汁。正常人體腸膽汁鹽含量在0.3～3.0 mg/mL，汪川等[18]探索了104 株人源性乳酸桿菌對酸和膽鹽耐受性，發現80%以上菌株在3.0 mg/mL膽鹽中培養4 h后的活菌數下降2（lg（CFU/mL）），且耐酸（pH 3.0）能力普遍強于耐膽鹽（3.0 mg/mL）能力。劉吉成等[19]研究了雙歧桿菌在不同質量濃度膽鹽環境下的活菌數，結果顯示在含3.0 mg/mL膽汁鹽3 h時的活菌數已下降1（lg（CFU/mL））。Li Jia等[6]的研究顯示4 株不同雙歧桿菌在3.0 mg/mL膽汁鹽中作用20 h后的活菌數下降了3（lg（CFU/mL））以上，其中長雙歧桿菌下降4（lg（CFU/mL））。而NCU712在含3.0 mg/mL膽鹽的改良MRS培養基作用20 h后，活菌數由4.0×107CFU/mL降到1.0×106CFU/mL，下降了1（lg（CFU/mL）），可見NCU712對膽鹽具有一定的耐受性。

3 結 論

雙歧桿菌是人體腸道內最重要的益生菌，利用添加X-Gal的改良MRS作為選擇性培養基初篩得到75 株疑似雙歧桿菌，經復篩、生理生化鑒定及分子生物學鑒定后，確定菌株NCU712為長雙歧桿菌。在胃液pH 2.5時，菌株NCU712的D值為30.42 min；胃液pH 3.0時，D值為92.97 min，作用2.5 h活菌數仍有107CFU/mL；胃液pH 3.5和4.0時，活菌數隨作用時間的延長而略有上升。NCU712在人工腸液中作用4.0 h后，活菌數仍有108CFU/mL。菌株NCU712在3 mg/mL膽鹽的改良MRS培養基中培養24 h后，活菌數下降1（lg（CFU/mL））。可見NCU712對人體胃腸道逆環境耐受性較好。因此長雙歧桿菌NCU712具有一定的應用潛力，其生物活性功能及應用于食品的安全性分析還有待于進一步研究。

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Screening of Bifidobacteria with Acquired Excellent Tolerance to Human Gastrointestinal Tract

XIONG Tao, HUANG Qiao-fen, DU Man
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Totally 75 suspected bifidobacterium were obtained in modified MRSC broth with 60 mg/mL X-Gal. Of these strains, 11 with high viability were screened by simulating the micro-environment of the human gastrointestinal tract using MRSC broth (pH 3.0) and then MRSC with 3 mg/mL bile salt for 20 h. Physiological and biochemical tests were conducted on NCU712, NCU701, and NCU708. They were all identified as B. longum via 16S rDNA sequencing. NCU712 was in line with the characteristics of B. longum. Preliminary study on its tolerance to the human digestive environment was conducted. The results showed that the viable count rose slightly with increasing incubation time when the pH of artificial gastric fluid equaled or exceeded 3.5. The death value (the time it takes to kill 90% of cells) of NCU712 was 92.97 min and 30.42 min in artificial gastric fluid at pH 2.5 and pH 3.0, respectively. The number of viable NCU712 cells remained more than 107CFU/mL after 2.5 h. The number of living bacterium remained above 108CFU/mL after 4.0 h in artificial intestinal fluid. The number of viable NCU712 cells was reduced by one order of magnitude after being incubated in MRSC with 3 mg/mL bile salt for 24 h. In summary, B. longum NCU712 has excellent tolerance to the human gastrointestinal tract and may be regarded as functional probiotic with great application potential.

Bifi dobacterium; screening and identification; gastrointestinal tract; tolerance

Q93-3

A

1002-6630（2014）13-0161-05

10.7506/spkx1002-6630-201413031

2013-09-13

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100904）；國家重點實驗室目標導向項目（SKLF-ZZA-201303）；江西省教育廳科技落地計劃項目（贛財教[2011]243號）

熊濤（1970—），男，教授，博士，研究方向為益生菌及大宗果蔬高值化利用。E-mail：xiongtao0907@163.com