羊羔美酒大曲中酵母菌多樣性及分子鑒定

李 艷，董振玲，牟德華,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

羊羔美酒大曲中酵母菌多樣性及分子鑒定

李 艷1,2，董振玲1，牟德華1,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

目的：分離和鑒定羊羔美酒大曲中的酵母菌，探尋酵母菌群多樣性組成，為深入研究羊羔美酒的風味特征奠定基礎。方法：對羊羔美酒大曲實施多點采樣、混合研磨、無菌水梯度稀釋、平板畫線分離、挑取酵母菌單菌落。酵母菌的形態鑒定采取菌落特征和顯微細胞特征結合的方法，分子鑒定采用5.8S rDNA-ITS區域限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析及序列分析法。結果：從羊羔美酒大曲中共分離出474株酵母菌，傳統形態學鑒定為14種形態類型，經5.8S rDNA-ITS區域RFLP分析法區分為6種分子類型。經基因序列分析，將其鑒定為分屬于6個屬的6種酵母菌，分別為：異常畢赤酵母（Pichia anomala）、釀酒酵母（Saccharomyce cerevisia）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、黏質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。結論：羊羔美酒大曲中酵母菌多樣性豐富，除釀酒酵母外，還含有多種酵母菌輔助代謝產生各種風味物質，其中釀酒酵母為主要優勢菌群。

羊羔美酒大曲；酵母菌；形態分類；5.8S rDNA-ITS區域RFLP分析

羊羔美酒選用優質北方黍米、鮮嫩羊肉、新鮮水果及名貴中藥材為原料，經過黍米蒸飯與預先熬制的嫩羊肉湯和果藥汁混合，拌以大麥曲進行糖化和發酵，經過濾和3年以上陳釀而成，酒液呈琥珀色，酒度為17°，融酯香、奶香、果香、藥香于一體，酸甜適度、風格獨特、營養價值很高，具有滋陰潤肺、增補元氣、壯腰益腎、開胃健脾、養肝明目及烏發美容的功效，是中國獨有的高級滋補保健酒。羊羔美酒隸屬我國傳統黃酒范疇，但又有若干獨特之處，僅釀酒用曲就體現一大特色，作為羊羔美酒的生命之源，探討酒的風味必先預知酒曲微生物及酶系組成，而對于釀酒來說，酵母菌是眾多微生物中將糖轉化為酒的主要生命體，因此研究酵母菌群的組成可為深入研究酒的風味特點奠定良好的基礎[1]。目前，國內對于酒曲微生物的研究主要集中于白酒酒曲[2-4]，而且對酒曲中霉菌的研究較多[5-6]，對于黃酒酒曲中酵母菌的研究報道較少，而對這款北方獨特的黃酒羊羔美酒酒曲中酵母菌的尚屬首例。

本研究以羊羔美酒釀造用酒曲為原料，以酵母菌為研究對象，在培養條件下分離篩選酵母菌，并進行傳統的形態分類和分子生物學鑒定，為探明羊羔美酒的奧秘和我國特色黃酒的風味特征研究奠定基礎，具有深遠的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

羊羔美酒大曲由河北味道府酒業有限責任公司提供。

1.2 試劑與培養基

配制培養基的各種試劑和生化試劑，包括引物ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’），ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’），限制性內切酶HaeⅢ、HinfⅠ、HhaⅠ等均為分析純，購自生工生物工程（上海）技術服務有限公司。

酵母菌培養用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基[7-8]：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然，121℃滅菌20 min。

酵母菌形態鑒定用Wallerstein Laboratory（WL）培養基：葡萄糖50 g/L、胰蛋白胨5 g/L、酵母浸粉4 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鐵0.25 mg/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸錳0.25 mg/L、溴甲酚綠22 mg/L、瓊脂20 g/L，pH 5.5。

1.3 儀器與設備

PCR儀、凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；瓊脂糖水平板電泳儀 北京六一公司。

1.4 方法

1.4.1 酒曲中酵母菌的分離

干酒曲中酵母菌的分離：從羊羔美酒用大曲餅的外表面、中間和內部分別取樣，混合研磨成粉，取1 g加入100 mL無菌水，置于搖床上150 r/min、30 min，靜止，取其上清液進行一系列10倍梯度稀釋[9]，選擇適宜的稀釋梯度，取0.2 mL稀釋液于YEPD培養基進行28 ℃涂布培養，2 d后從平板上挑取酵母菌，再劃線接種于相同培養基得單菌落。

培養狀態下酵母菌的分離：分別以大米、糯米為酒曲活化基質進行微生物的富集培養，同時以黍米的羊羔美酒發酵過程為對照，在接種后第0、1、2、4、6、8、10、14、18、25天分別取樣進行酵母菌分離純化，培養溫度為30 ℃和25 ℃。取樣基質1 g，加100 mL無菌水打漿，取5 mL漿液進行系列10倍梯度稀釋，選3個合適的稀釋度0.2 mL進行3個平行平板的涂布分離培養。28 ℃培養2 d，進行菌落計數并挑取酵母菌，再劃線接種于相同培養基得單菌落。

1.4.2 酵母菌的形態聚類

將獲得的酵母菌用YEPD培養基進行活化復篩，劃線接種于WL培養基，28 ℃培養5 d，觀察酵母菌在WL培養基上菌落的顏色、形態、表面是否光滑、邊緣是否整齊等菌落特征。同時，在顯微鏡下觀察酵母的細胞形態。以此對分離到的酵母菌株進行初步的形態聚類[10-11]，并進行保藏。

1.4.3 酵母菌的分子鑒定

酵母菌的分子鑒定的方法采用5.8S rDNA-ITS區域限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析法。經初步形態聚類的酵母菌分別取一株代表菌株，用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）熱裂解法[12]提取基因組DNA，用引物ITS1和ITS4對菌株的5.8S rDNA-ITS區進行基因擴增[13-14]。PCR反應混合液包括：雙蒸水33.65 ?L，Buffer 10 ?L，dNTP 1 ?L，正向引物2 ?L，反向引物2 ?L，DNA模板1 ?L，Taq酶0.35 ?L，反應總體積為50 ?L。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min，變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共35個循環，最后72 ℃延伸3 min。將得到的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色10 min，凝膠成像分析儀下觀察并攝影。

5.8 S-ITS區域基因擴增產物限制性酶切分析（20 ?L）：雙蒸水9 ?L，Buffer 2 ?L，PCR產物8 ?L，內切酶（HaeⅢ 、HinfⅠ、HaeⅢ）1 ?L。酶切條件：37 ℃水浴2.5 h。取出置于4 ℃冰箱保存。酶切產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，酶切產物加樣量8 ?L與1 ?L 的10×Loading buffer混勻后加樣，加入5 ?L的Marker為對照，電泳電壓為70～80 V，時間60～70 min，溴化乙錠染色10 min，凝膠成像分析儀下觀察并攝影。

將酵母菌株5.8S rDNA ITS區PCR產物送至生工生物工程（上海）技術服務有限公司，委托其進行基因序列測定。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，進行同源性分析。下載相關菌株序列信息，使用MEGA4軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統樹圖，并以Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析。

1.4.4 羊羔美酒發酵過程中酵母菌群動態微生態結構研究

根據酵母菌的形態菌類結果與分子鑒定結果，對羊羔美酒發酵過程中分離到的不同種類的酵母菌種類與數量進行統計分析，分析發酵過程各類酵母所占比例和變化規律[9]。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的形態聚類

經分離純化共得到474株酵母菌，其中非培養狀態下得到17株，大米和糯米為培養基質，不同培養溫度條件下得到152株，在羊羔美酒發酵生產過程中分離得到305株。依據在WL培養基上長出的酵母菌菌落形態和顏色特征，結合顯微鏡下觀察酵母菌的細胞形態，可將其區分為14種形態類型，結果見表1。

不同種類的酵母菌在WL營養培養基上生長的菌落顏色和形態不同，因此可作為酵母菌鑒別性培養基。在羊羔美酒大曲中分離得到的酵母菌絕大多數可以用WL培養基進行區分，再結合不同酵母菌的細胞顯微形態不同，可以將酵母菌進行初步形態聚類分析。從表1可以看出，成品干曲中僅可分離到1種類型的酵母菌。而在利用大米和糯米為培養基質，25 ℃和30 ℃培養條件下可分離到8種形態類型的酵母菌。在以黍米為原料的羊羔美酒發酵過程中，分離得到了13種形態類型的酵母菌。其中，形態2是成品曲中分離到的唯一酵母菌，它同時出現在各種分離條件下和實際生產過程中，根據其形態學特征，可以初步判定為釀酒酵母，其數量也占分離酵母菌的最大比重，為典型的優勢菌群，顯微鏡下其細胞形態如圖1。

圖1 優勢酵母菌的細胞（a）和菌落（b）形態（×4400）Fig.1 Cellular (a) and colony (b) morphology of the predominant yeast species (×4400)

2.2 酵母菌株5.8S rDNA- ITS區RFLP分析

圖2 5.8S rDNA-ITS區域PCR產物電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoretogram of 5.8S rDNA-ITS region

目前，鑒定酵母菌常用的分子手段是酵母菌的5.8S rDNA-ITS區RFLP分析，其原理是酵母菌5.8S rDNA及兩側的內轉錄間隔區（ITS區）既有高度保守性又具有明顯的種間差異性，因此可以作為區分鑒定酵母菌的分類依據[15-18]。本研究在WL培養基進行酵母菌形態聚類分析的基礎上，從每種形態類型中隨機選擇1株酵母菌進行核糖體5.8S-ITS區基因擴增，14種形態酵母菌的5.8S- ITS區rRNA基因擴增產物電泳圖見圖2。同時使用HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶對PCR擴增產物進行酶切分析，酶切電泳圖譜見圖3。

表1 WL培養基上酵母菌的形態特征及數量Table 1 Morphological characteristics and number of the yeasts on WL medium

圖3 PCR產物的3種限制性內切酶酶切分析圖譜Fig.3 Restriction analysis patterns of the PCR-amplified 5.8S-ITS region

14種酵母菌的PCR產物大小均在500～800 bp，經過HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶進行酶切后，可以將其區分為6種分子類型。Ⅰ類：包括形態1和8，PCR產物大小為626 bp，經HaeⅢ、HinfI和HhaI酶切后，均產生1個酶切片段，分別為600、281、567 bp。Ⅱ類：包括形態2、3、5、6、7、9和11，PCR產物大小為850 bp，經HaeⅢ酶切后，有4個酶切片段，即310、230、179 bp和125 bp；經HinfⅠ酶切后，有2個酶切片段，345 bp和120 bp；由HhaⅠ酶進行酶切后，有2個主要酶切片段，364 bp和335 bp。Ⅲ類：形態4，PCR產物大小為536 bp，經HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶切后，均產生1個酶切片段，分別為481、224、268 bp。Ⅳ類型：形態10，PCR產物大小為616 bp，經HaeⅢ酶切后，有2個酶切片段，406 bp和221 bp；經HinfⅠ酶切后，有2個酶切片段，353 bp和225 bp；由HhaⅠ酶進行酶切后，有2個酶切片段，292 bp和223 bp。Ⅴ類型：形態12和13，PCR產物大小為621 bp，經HaeⅢ酶切后，有1個酶切片段，504 bp；經HinfⅠ酶切后，有3個酶切片段，335、144 bp和117 bp；由HhaⅠ酶進行酶切后，有1個酶切片段，309 bp。VI類型：形態14，PCR產物大小為514 bp，經HaeⅢ酶切后，有1個酶切片段，336 bp；經HinfⅠ酶切后，有2個酶切片段，217 bp和133 bp；由HhaⅠ酶進行酶切后，有1個酶切片段，348 bp。結合5.8S rDNA-ITS區基因PCR擴增結果及其限制性內切酶HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶切片段的RFLP分析，可將14種酵母菌區分為6類，見表2。

表2 酵母菌5.8S rDNA -ITS區域RFLP分析Table 2 Results of RFLP analysis of 5.8S rDNA-ITS region of yeast isolates

2.3 酵母菌株5.8S-ITS區基因序列分析

本研究將酵母菌的5.8S rDNA-ITS區域RFLP分析結果與本研究室已經過測序的酵母菌進行了比對，發現分子類型Ⅱ，包括形態類型2、3、5、6、7、9、11酵母菌的5.8S rDNA-ITS 區 RFLP分析結果與自選釀酒酵母（編號KDLYC19-255，GenBank登錄號：HQ909096）完全一致，因此可確定其為釀酒酵母[19]。其余5種分子類型的酵母菌隨機選擇1株進行基因測序，將所得基因序列結果登錄GenBank數據庫，進行BLAST（http: // www. ncbi. nlm. nih. gov /blast /Blast. cgi）相似性比對，以相似度大于99%確定其屬種，測序結果見表3。

表3 酵母菌5.8S rDNA-ITS區序列分析結果Table 3 Sequence analysis of the 5.8S rDNA-ITS region of yeast

結合表2、3可以看出，經過形態學區分和分子生物學鑒定，可以將14種形態的酵母菌區分成6種5.8S rDNA-ITS區RFLP類型，歸屬到6個屬中的6種酵母菌，分別為異常畢赤酵母（Pichia anomala）、釀酒酵母（Saccharomyce cerevisia）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、黏質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。

通過Neighbor-Joining法構建的系統發育樹可以判斷酵母菌的同源關系，如圖4所示。在系統發育樹上同一分支的酵母同源關系最近，從聚類結果可以清楚的看出所分離酵母菌的分類情況及各自的種屬名稱。

圖4 基于5.8S rDNA-ITS區序列和Neighbor-Joining法構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS region sequences by neighbor-jointing method

2.4 羊羔美酒發酵過程中酵母菌群動態微生態結構

圖5 羊羔美酒發酵過程中第一批（a）和第二批（b）酵母菌的菌群動態變化Fig.5 Yeast population dynamics during Yanggaomeijiu fermentation

羊羔美酒發酵過程中存在的酵母菌包括產酒精酵母和產酯酵母，酒精酵母利用可發酵糖轉化為乙醇，產酯酵母可產酯或產酸，與酒體香氣、口感密切相關。這些酵母菌從酒曲或發酵環境中進入發酵醪液，在發酵前期利用可發酵糖生長繁殖，隨著發酵的進行，酒精含量逐漸升高，低發酵能力和酒精耐受力較差的微生物菌株逐漸被抑制或消亡，到發酵中后期，發酵能力強、耐酒精能力好的酵母成為優勢菌群。羊羔美酒發酵過程中酵母菌的菌群動態變化見圖5。從整體來看，兩批發酵過程中大體趨勢相同，都是以釀酒酵母為主要優勢菌，其他類型的酵母菌在發酵過程中出現的種類和比例略有不同。分析可能是由于酒曲的批次不同，導致在后續的發酵過程中菌群出現了波動。畢竟酒曲的制備過程是在一個開放的環境中，網羅自然環境的微生物群落，環境的微改變可能會影響酒曲最終微生物比例的波動。羊羔美酒的發酵也是傳統的開放式發酵環境，使用的器具、設備及周圍的環境中存在的微生物均對研究結果產生影響。

羊羔美酒發酵前期第0～5天，存在的酵母菌有Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomala和Rhodotorula mucilaginosa，前2 d的主要菌群為Saccharomyces cerevisiae。第3～5天，第一批主導酵母菌群是Saccharomyces cerevisiae釀酒酵母菌，第二批優勢酵母菌群為Saccharomyces cerevisiae和Pichia anomala。發酵5 d以后至15 d時，第二批發酵醪液中的酵母菌群明顯豐富，有Saccharomyces cerevisiae、Trichosporon asahii、Pichia anomala和Cryptococcus albidus等，在第7天大量出現Pichia anomala和Rhodotorula mucilaginosa酵母菌，而在第10天時Saccharomyces cerevisiae酵母菌占主導優勢，此后的15 d最多的酵母菌為Trichosporon asahii和Saccharomyces cerevisiae，而第一批發酵在該階段的優勢菌群依然是酵母菌Saccharomyces cerevisiae，發酵后期，即發酵15 d以后，羊羔美酒發酵醪液中的優勢菌群為Saccharomyces cerevisiae酵母菌。

釀酒酵母是成品酒曲的主體酵母菌，采用大米和糯米為基質培養酒曲分離到的酵母菌中釀酒酵母仍為主體菌株，在羊羔美酒實際生產過程中依然是釀酒酵母為主發酵菌，它將糖轉化為乙醇，符合黃酒發酵的一般規律[20]。分子類型Ⅲ即形態類型4的絲孢酵母，有分解脂肪的能力，且耐酒精度有時可達17%以上，因此在發酵后期酒精濃度很高的條件下仍可以分離到該酵母菌[21]。分子類型Ⅵ即形態類型14為東方伊薩酵母，劉婷婷[22]在酒曲或出池酒醅中曾分離到此菌株，其結果表明東方伊薩酵母在42 ℃條件下仍有較好的生長。在本實驗麥曲制作過程中有55～60 ℃的高溫階段[23]，另外可能由于其對發酵環境的變化耐受力弱，因此本研究中分離到該菌的數量很少。形態類型1、10、12分別為Pichia anomala（異常畢赤酵母）、Rhodotorula mucilaginosa（黏質紅酵母）、Cryptococcus albidus（淺白隱球酵母），曹鈺等[24]的研究結果中也有發現，但其具體性能還未見報道，需要進一步研究。

3 結 論

本實驗研究了對羊羔美酒用大曲中酵母菌的多樣性和優勢酵母菌群。共分離到酵母菌474株，形態聚類和分子鑒定的結果顯示出羊羔美酒大曲中酵母菌的多樣性。通過基因序列分析最終鑒定出分屬于6個屬的6種酵母菌。釀酒酵母為主要優勢菌群。本實驗將傳統酵母菌的形態學分析與現在分子技術相結合，通過基因序列分析使菌種鑒定的結果準確性和可靠性提高。研究結果可以反映羊羔美酒大曲中酵母菌的多樣性，為進一步研究具有我國北方特色的地方性名酒風味物質特征、改進傳統的配料和釀造工藝提供參考。

[1] 萬自然. 大曲培養過程中微生物及酶的變化[J]. 釀酒科技, 2004(4): 25-26.

[2] 劉婷婷, 張明春, 曾馳, 等. 白云邊酒大曲及小麥原料中主要微生物的分析[J]. 中國釀造, 2010, 29(11): 32-34.

[3] 李健容, 蔡愛群. 民間傳統酒曲主要微生物的分離及鑒定[J]. 釀酒科技, 2007(5): 111-121.

[4] 張明春, 曹敬華, 向葦, 等. 白云邊釀酒大曲微生物分析研究[J]. 釀酒科技, 2010(2): 65-67.

[5] 趙文婧, 張楊, 孫慧靜. 山西后溝堡子酒大曲中優勢霉菌的分離及鑒定[J]. 廣東農業科學, 2011(18): 69-71.

[6] 武晉海, 于亮, 王昌祿, 等. 茅臺酒大曲中3株耐高溫霉菌的分離純化及鑒定[J]. 釀酒科技, 2007(3): 17-19.

[7] 王鳳梅, 馬利兵, 劉樹文. 內蒙古土默川平原葡萄酒相關酵母多樣性研究[J]. 食品與生物技術學報, 2009, 28(3): 385-389.

[8] 李艷, 盧君, 張利中, 等. 沙城龍眼葡萄自然發酵過程相關酵母生物多樣性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(21): 237-240.

[9] 楊美景, 陳小波, 趙靜靜, 等. 赤霞珠葡萄自然發酵過程中酵母菌的分離與鑒定[J]. 食品與發酵工業, 2011, 37(7): 22-27.

[10] 楊雪峰, 蘇龍, 劉樹文. 利用WL營養培養基鑒定葡萄酒中的相關酵母菌[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2006(4): 4-7.

[11] 薛軍俠, 徐艷文, 楊瑩, 等. WL培養基在釀酒酵母篩選中的應用[J].中國釀造, 2007, 26(9): 36-39.

[12] 盧君. 沙城產區龍眼葡萄相關酵母菌生物多樣性研究及優良酵母菌種的篩選[D]. 石家莊: 河北科技大學, 2010.

[13] CHAVAN P, MANE S, KULKARNI G, et al. Natural yeastora of different varieties of grapes used for wine making in India[J]. Food Microbiology, 2009, 26: 801-808.

[14] BAUTISTA-GALLEGO J, RODR?GUEZ-GóMEZ F, BARRIO E, et al. Exploring the yeast biodiversity of green table olive industrial fermentations for technological applications[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 147(2): 89-96.

[15] 盧君, 李艷. 分子生物學技術在葡萄酒相關酵母菌分類鑒定中的應用及研究進展[J]. 釀酒科技, 2009(6): 92-98.

[16] JAMES S A, COLLINS M D, ROBERTS I N. Use of an rRNA internal transcribed spacer region to distinguish phylo-genetically closely related species of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1996, 46(1): 189-194.

[17] SANTO D E, GALEGO L, GON?ALVES T, et al. Yeast diversity in the Mediterranean strawberry tree (Arbutus unedo L.) fruits’fermentations[J]. Food Research International, 2012, 47(1): 45-50.

[18] ESTEVE-ZARZOSO B, BELLOCH C, URUBURU F, et al. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1999, 49: 329-337.

[19] 楊美景. 河北省昌黎釀酒葡萄產區相關酵母菌分布規律研究[D]. 石家莊: 河北科技大學, 2011.

[20] 熊子書. 中國釀酒酵母菌的研究: 不同酒類酵母篩選與應用紀實[J].釀酒科技, 2002(4): 19-21.

[21] 毛青鐘, 劉瑾. 黃酒酒藥微生物和在釀造中的作用[J]. 食品工業科技, 2004(5): 138-140.

[22] 劉婷婷. 白云邊酒釀造微生物分析及東方伊薩酵母發酵特性研究[D]. 武漢: 武漢工業學院, 2011.

[23] 汪建國. 傳統麥曲在黃酒釀造中的作用和特色[J]. 中國釀造, 2004, 23(10): 29-31.

[24] 曹鈺, 陳建堯, 謝廣發, 等. 黃酒麥曲天然發酵中真菌群落的成因初探[J]. 食品與生物技術學報, 2008, 27(5): 95-100.

Diversity and Molecular Biological Identification of Yeast Strains from Yanggaomeijiu Liquor Fermentation Starter (Daqu)

LI Yan1,2, DONG Zhen-ling1, MOU De-hua1,*
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Research & Development Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China)

Purpose: The aims of this work were to isolate and identify yeast strains from Yanggaomeijiu liquor fermentation starter (Daqu) and to explore the diversity of yeast in Yanggaomeijiu Daqu. Methods: To analyze Yanggaomeijiu Daqu, multipoint sampling, mixing and grinding the samples, a serial dilution with sterile water, streak plating and single colony picking were used in this study. Conventional microbiological analysis and RFLP analysis of the 5.8S-ITS region were conducted to identify the yeast species. Results: A total of 474 yeast isolates were directly obtained from Yanggaomeijiu Daqu, and they can be divided into 14 different groups by conventional microbiological analyses and into 6 genotypes by RFLP analysis of the 5.8S-ITS region. By gene sequencing, 6 different yeast species belonging to 6 genera were detected in the Daqu samples tested, including Pichia anomala, Saccharomyce cerevisia, Trichosporon asahii, Rhodotorula mucilaginosa, Cryptococcus albidus and Issatchenkia orientalis. Conclusions: The yeast diversity in Yanggaomeijiu Daqu was abundant. Besides Saccharomyce cerevisia, there were various yeast species contributing to various kinds of flavor substances, and the predominant yeast was Saccharomyce cerevisia.

Yanggaomeijiu Daqu; yeast; morphological classification; RFLP analysis of 5.8S rDNA-ITS region

TS261.1

A

1002-6630（2014）05-0144-06

10.7506/spkx1002-6630-201405029

2013-08-27

河北省自然科學基金項目（C2011208028）；河北省石家莊市科技支撐計劃項目（101171271A；10117901A）

李艷（1958—），女，教授，本科，研究方向為飲料酒釀造技術。E-mail：lymdh5885@163.com

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，本科，研究方向為農產品加工。E-mail：dh_mou@163.com