骨橋蛋白及CD44v6在肺腺癌侵襲轉移中的作用

王安雷，孫冰生，張真發

(天津市腫瘤防治重點實驗室、天津市肺癌診治中心、天津醫科大學腫瘤醫院，天津300060)

肺腺癌可分為浸潤前病變、微浸潤腺癌、浸潤型腺癌、浸潤型腺癌的變異型。原位肺腺癌(AIS)屬浸潤前病變，直徑＜3 cm的非黏液型細支氣管肺泡癌定義為AIS，腫瘤細胞僅沿原有的肺泡結構生長(伏壁樣生長)，無間質、血管或胸膜浸潤，可表現為乳頭狀或微小乳頭狀生長模式，而肺泡內腫瘤細胞缺如［1］;伏壁樣生長為主型腺癌(LPA)屬浸潤性腺癌，由AIS進展而來。骨橋蛋白(OPN)是一種分泌性鈣結合磷酸化蛋白，通過與其受體整合素、CD44等結合來促進細胞的趨化、黏附和遷移。2012年6月～2013年9月，我們檢測了 OPN及其受體CD44v6在肺腺癌細胞系中的表達情況，觀察二者對肺腺癌侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年6月～2012年6月在天津醫科大學腫瘤醫院行手術治療的原發性肺癌患者129例，男89例、女40例，年齡40～75歲、中位年齡60歲。病理診斷依據肺腺癌國際多學科分類標準［1］，術前均未接受放療或化療治療。其中AIS 36例，LPA 66例，癌旁組織(與原發病灶距離 ＞5 cm)27例。NCI-H358細胞來源于AIS，細胞購自上海復祥生物公司;A549細胞來源于侵襲性腺癌，由天津醫科大學表觀遺傳調控與腫瘤發生實驗室提供;PG-BE1細胞來源于肺巨細胞癌高轉移亞型，購自上海拜力生物公司。由于OPN在PG-BE1細胞中高表達［2］，因此以PG-BE1細胞培養基上清代替OPN作為趨化因子。三種細胞均用含胎牛血清10%的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測 取手術切除組織制成石蠟標本，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高溫高壓抗原修復，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清工作液封閉，滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。OPN著色部位在細胞質，陽性細胞內呈彌漫性棕黃色;CD44v6著色部位在細胞膜，陽性細胞膜呈棕黃色。用評分法統計免疫組化染色結果，陽性細胞著色強度計分:不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分;著色細胞百分數計分:著色細胞＜10%為0分，≥10%且＜40%為1分，≥40%且＜70%為2分，≥70%為3分。將著色強度計分與著色細胞百分數計分的乘積作為總計分，0分者為陰性，≥1分為陽性。

1.2.2 Western blot檢測 細胞培養72 h后，加入RIPA細胞裂解液，離心，10%SDS-PAGE分離細胞蛋白，轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h。分別加入 OPN、CD44v6、GAPDH的一抗，4℃過夜，TBST洗滌，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，加顯色劑，X線膠片曝光成像。

1.2.3 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物根據GenBank登錄的人目的基因cDNA序列設計，由上海英濰捷基公司合成。OPN引物序列:上游引物:5'-TGGCCGAGGTGATAGTGTG-3'，下游引物:5'-CGGGGATGGCCTTGTATG-3';CD44v6引物序列:上游引物:5'-CCAGGCAACTCCTAGTAGTACAAC-3'，下游引物:5'-GGGAGTCTTCTCTGGGTGTTTG-3';GAPDH引物序列:上游引物:5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，下游引物:5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3'。以 GAPDH作為內參照進行分析。

1.2.4 Transwell小室試驗 ①Transwell小室制備:將Matrigel用含1%胎牛血清的RPMI1640培養基按1∶3 稀釋，每個 Transwell小室用50 μL Matrigel稀釋液包被小室底部膜的上室面，37℃培養6 h。②制備細胞懸液:消化H358、A549細胞，PBS清洗，用含1%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸，調整細胞濃度至1×105/L。③接種細胞:24孔板分4組，上室中分別加入100 μL含CD44v6抗體H358細胞懸液、不含CD44v6抗體H358細胞懸液、含CD44v6抗體A549細胞懸液及不含CD44v6抗體A549細胞懸液，下室分別加入10%FBS RPMI1640培養基、PG-BE1細胞培養基中加入OPN抗體、PG-BE1細胞培養基作為趨化因子。37℃培養24 h。④結果統計:將Transwell小室用PBS清洗，1%甲醛固定，用棉簽擦去基質膠，結晶紫染色，PBS清洗。倒置顯微鏡下放大200倍計數。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件，數據的比較采用χ2檢驗，OPN與CD44v6的關系采用雙變量相關性分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OPN、CD44v6在肺癌及癌旁組織中的表達LPA、AIS及癌旁組織中OPN的表達陽性率分別為59.1%、27.8%、22.2%，CD44v6 分別為 84.8%、63.9%、22.2%，OPN、CD44v6 在 LPA 中的表達均明顯高于AIS及癌旁組織(P均＜0.05)。相關性分析顯示，OPN與CD44v6表達呈正相關(r=0.62，P＜0.05)。

2.2 OPN、CD44v6在肺腺癌細胞系中的表達OPN、CD44v6在 A549細胞中的表達均明顯高于H358細胞(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 OPN、CD44v6在A549細胞和H358細胞中的表達

2.3 OPN、CD44v6 mRNA在肺腺癌細胞系中的表達 以 GAPDH作內參，OPN、CD44v6 mRNA在H358細胞和A549細胞中的表達量比值為1∶5.7;CD44v6 mRNA在H358細胞和A549細胞中的表達量比值為 1∶8.2。OPN、CD44v6 mRNA 在 A549 細胞中的水平高于H358細胞(P均＜0.05)。

2.4 Transwell試驗結果 與對照組比較，以OPN作為下室趨化因子后，H358細胞穿過數增加了67%，A549細胞穿過數增加了250%，A549細胞的侵襲力高于H358細胞(P＜0.05)。通過OPN抗體阻斷OPN對兩種細胞的趨化作用后，H358細胞穿過數下降約30%，A549細胞穿過數下降約64%;阻斷CD44v6受體通道后，OPN對兩種細胞的趨化作用明顯減弱，H358細胞穿過數下降約20%，A549細胞穿過數下降約21%。

3 討論

本研究顯示，隨著肺癌侵襲程度的增加，OPN的表達逐漸增高，提示OPN在肺腺癌進展中起重要作用，與 Chang等［3］的報道一致。A549細胞中的OPN蛋白及 mRNA水平明顯高于 H358細胞。Zhang等［4］報道，OPN在肺癌組織和肺癌細胞系中均過度表達，特別在晚期轉移腫瘤患者的惡性腫瘤細胞中過度表達，表明OPN可能與腫瘤細胞遷移和轉移有關。Transwell試驗提示，OPN對A549細胞的趨化作用高于H358細胞;通過OPN抗體阻斷OPN對兩種細胞的趨化作用后，A549細胞穿過數下降幅度高于H358細胞，提示A549細胞較H358細胞對OPN更敏感。楊艷娟等［5］對OPN在同類型肺癌組織表達的研究中發現，OPN的表達與腫瘤分化程度無關，而與臨床分期有密切關系，認為OPN可作為肺癌轉移的間接證據。Hu等［2］通過對非小細胞肺癌患者進行免疫組化測定發現，OPN在原發性非小細胞肺癌中普遍過度表達，認為OPN在肺癌發生和進展中具有重要作用。OPN參與了腫瘤發展的多個環節，有可能作為預測肺癌發生進展的潛能指標。OPN在其他腫瘤的發展轉移中也具有重要意義，Chen等［6］研究發現，降低OPN的表達可以減少肝細胞癌的轉移，以OPN作為靶向治療可有效預防肝細胞癌轉移。

CD44是一種被各種細胞包括腫瘤細胞廣泛表達的細胞表面糖蛋白，作為細胞間的黏附分子參與細胞—基質、細胞—細胞之間的特異性黏附過程。在淋巴細胞歸巢、血細胞生成、細胞移動及轉移中起重要作用［7］。CD44v6是CD44的一種拼接變異體，CD44v6的表達可能改變腫瘤的構成和功能，有助于腫瘤細胞獲得轉移潛能。本研究顯示，隨著腫瘤的進展，CD44v6的表達依次遞增，提示CD44v6表達與肺腺癌的發生進展具有密切關系;CD44v6蛋白及mRNA在A549細胞中的表達量高于H358細胞。楊艷娟等［5］研究發現，CD44v6表達水平與肺癌分化程度無明顯關系，但與組織學類型、分期和淋巴轉移有密切關系。CD44v6的異常表達與許多人類惡性腫瘤的發生、發展、侵襲轉移及預后密切相關［8］。

本研究對OPN、CD44v6表達進行相關性分析，發現OPN與 CD44v6表達呈正相關。Elli等［9］報道，惡性淋巴瘤患兒血清中的OPN和CD44水平呈正相關，與腫瘤分期密切相關。Transwell試驗提示，阻斷CD44v6受體通道后，OPN對兩種細胞的趨化作用明顯減弱，提示CD44v6在OPN對肺腺癌的侵襲發展具有重要影響。Zohar等［10］認為，OPN 與CD44v6結合形成的復合體可能對加強細胞遷移過程中腫瘤細胞與基質的快速而短暫的接觸起重要作用。Rao等［11］研究發現，CD44陽性的結腸癌細胞分泌更多的OPN，通過抗體阻斷CD44后，OPN分泌量減少;OPN-CD44v6復合體與結腸癌患者生存呈負相關。Phillips等［12］發現，OPN與細胞表面受體CD44結合后，在肝癌增殖過程中起重要作用，OPN介導腫瘤細胞增殖能力依賴于CD44。Frey等［13］發現，OPN與MMP-9呈正相關，與EGFR信號通路有聯系。CD44的表達使癌細胞容易發生細胞黏附，MMPs的表達又使癌細胞容易進入血管形成癌栓，并促進腫瘤的血管生成，而OPN對兩者的表達有促進作用。其可能機制為:OPN含有RGD序列，并可通過RGD序列與CD44、CD44v6結合，激活MMPs，MMPs通過降解細胞外基質及基底膜的Ⅳ型膠原等成分，使癌細胞發生侵襲和轉移，多因素共同促進肺腺癌的演進和轉移。

綜上所述，OPN、CD44v6表達與肺腺癌進展密切相關，OPN-CD44v6復合體對肺腺癌的侵襲能力具有重要作用，OPN可能作為評估肺腺癌進展及預測腫瘤轉移潛能的指標。

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