盆腔腫瘤放療對兔直腸組織放射性纖維化形成的作用及機制

陳海燕，楊 旭，王沛靚

(新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊830011)

纖維化是機體組織受外界因素刺激后的一種修復過程，表現為細胞外基質的過度沉積［1］。放射性纖維化是惡性腫瘤患者臨床放射治療后常見并發癥［2］。放療是盆腔腫瘤主要的治療手段，大劑量放射治療可導致盆腔纖維化，包括直腸纖維化、輸尿管纖維化，嚴重者會誘發淋巴管阻塞和輸尿管梗阻［3］。研究發現，細胞因子在纖維化的形成過程中扮演重要角色，轉化生長因子(TGF-β)是盆腔放射性纖維化的關鍵因子［4］。2013年3～7月，我們對新西蘭大白兔給予放射線照射，探討放射性纖維化的形成機制。

1 資料與方法

1.1 材料 清潔級雌性新西蘭大白兔20只，體質量(2 000 ±200)g。TGF-β(mRNA)ISH DIG Kit購自天津顥洋生物制品科技有限責任公司;鼠抗兔Ⅲ型膠原單克隆抗體IgG購自美國Merck公司;NF-κB多克隆抗體、TGF-β多克隆抗體購自美國Santa Cruze公司;SP免疫組化試劑盒及濃縮型DAB試劑盒均購自日本株式會社同仁化學研究所。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 將兔隨機分成空白對照組、照射4周組、照射12周組和照射16周組，采用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢，首先確定X射線模擬機照射范圍，照射視野為恥骨聯合至恥骨聯合上緣4 cm，腹白線左右2 cm，視野范圍4 cm×4 cm。消毒腹部皮膚后，沿腹正中線切開，進入腹腔，給予6 MeV β射線單次大劑量照射，照射距離為100 cm，劑量為20 Gy，劑量率為400 cGy/min。照射結束后關腹，縫合。空白對照組操作過程同放射組，但不進行射線照射。術后室溫、常規飼養，自術后第2天開始皮下注射雌二醇0.05 mg/d，持續4 d。于照射4周、12周和16周末分別處死對應組動物，空白對照組于實驗完成時統一處死。

1.2.2 病理學檢查 取兔的直腸和輸尿管，10%甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切5～8 μm厚的切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木精染色，伊紅復染。再經乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光學顯微鏡下觀察HE染色情況。

另取石蠟切片行Azan染色，切片常規入水、水洗，放入37℃偶氮卡紅液中放置4 h，冷卻后蒸餾水清洗，用含1%苯胺的95%乙醇溶液分色，0.5%磷鎢酸水溶液放置3～5 min，再放入苯胺藍—橘黃G染液30 min，擦干后95%乙醇分色，乙醇梯度洗脫，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下評價放射性直腸纖維化的程度。

1.2.3 TGF-β、NF-κB 表達檢測 提取各組盆腔組織蛋白，采用蛋白印跡法檢測TGF-β、NF-κB表達，采用雙縮脲法測定直腸組織蛋白含量，制樣(含50 μg蛋白)，金屬浴5 min，冷卻后上樣。制備8% ～10%的 SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳2～4 h，轉移PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別用 TGF-β和NF-κB一抗孵育，4℃過夜，清洗，二抗室溫孵育1 h，清洗，ECL顯色，暗室洗片，行定量分析。

1.2.4 統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件，結果以±s表示，應用ANOVA檢驗多個均數間差異性，當組間存在顯著性差異時用t檢驗，進行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理學觀察 HE染色結果顯示，空白對照組直腸組織細胞排列整理，無炎性細胞浸潤;照射4周組可見少量炎性細胞浸潤和充血水腫;照射12周組可見大量炎性細胞浸潤，充血、水腫明顯，細胞腫脹、壞死、脫落，黏膜組織結構紊亂，結締組織呈纖維化改變;照射16周組可見巨噬細胞及中性粒細胞浸潤和典型的外結締組織纖維化改變。見圖1。

圖1 各組直腸組織HE染色結果

Azan染色結果顯示，空白對照組直腸組織中未見纖維化表達，照射4周組直腸組織中見少量藍色纖維化表達，照射12、16周組直腸組織中見大量纖維化表達。見圖2。

圖2 各組直腸組織Azan染色結果

2.2 直腸組織細胞因子變化 各組直腸組織中的TGF-β和 NF-κB蛋白表達見圖 3。直腸組織中TGF-β蛋白及核內NF-κB蛋白表達均隨照射時間的延長而增加。見圖3。

3 討論

圖3 直腸組織細胞因子變化

放射性纖維化是惡性腫瘤患者臨床放射治療后常見并發癥。本研究采用射線大劑量照射新西蘭大白兔后，檢測直腸組織病理學改變，空白對照組直腸組織中細胞排列整理，無炎性細胞浸潤，照射4～16周后可見大量炎性細胞浸潤、充血水腫明顯，細胞腫脹壞死，脫落，黏膜組織結構紊亂，結締組織呈纖維化改變。Azan染色空白對照組直腸組織中未見纖維化表達，照射第4～16周后見藍色纖維化表達，可見直腸組織中大量纖維化形成。

纖維化是機體組織受外界因素刺激后的一種修復過程，放射治療中常出現放射性纖維化，主要表現為細胞外基質的大量沉積以及成纖維細胞的過度繁殖。研究表明，纖維化的形成與發展是一個動態過程，存在不斷重建和成纖維細胞被長期激活等特點［5］。在慢性纖維化形成及發展的過程中，成纖維細胞的激活是關鍵。在纖維化形成期，始終伴隨著炎性細胞浸潤、大量巨噬細胞和內皮細胞聚集在新生毛細血管，同時并存著大量成纖維細胞，而這些成纖維細胞被激活后多成為細胞骨架蛋白，進而參與傷口的收縮。研究表明，TGF-β是盆腔放射性纖維化的關鍵因子，其表達程度與纖維化進程呈正相關［6～9］。TGF-β 具有多種生物學特性，主要包括:誘發一系列細胞內快速反應，如誘導細胞凋亡或改變細胞增殖情況等［10～12］;對細胞生長發揮負調節作用，如內皮細胞、上皮細胞、造血干細胞等;通過影響對細胞周期變化起調控作用的蛋白激酶的活性，抑制細胞增殖。TGF-β具有抑制細胞生長和增殖、誘導細胞凋亡的作用，因此通過影響TGF-β信號通路可能抑制腫瘤細胞的生長。

本研究顯示，直腸組織中TGF-β蛋白表達隨照射時間的延長而增加，表明放射線刺激后，直腸組織中TGF-β蛋白表達增多，從而促進纖維化的進程，病理形態學檢查也進一步驗證纖維化的形成。檢測直腸組織中NF-κB蛋白變化，可見核內NF-κB蛋白表達也隨照射時間的延長而增加，提示TGF-β蛋白的表達可能會影響下游信號通路，從而促進NF-κB蛋白的核轉錄。

綜上所述，TGF-β是放射性纖維化形成的關鍵因素，放射治療增加TGF-β蛋白表達，可能與促進NF-κB蛋白的核轉錄有關。以TGF-β為靶點分析放射性纖維化的進展和治療，為臨床治療提供了新的思路。

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