蛻皮甾酮對2型糖尿病大鼠肝細胞IRS-2蛋白表達的影響

朱玉霞，孫麗莎，楊 矯，陳 秋

(成都中醫藥大學附屬醫院，成都610075)

胰島素的主要靶器官是肝臟、骨骼肌及脂肪組織，主要生理效應包括其介導的葡萄糖攝取及處理、促進蛋白質和脂肪合成、抑制糖異生、抑制脂肪分解和酮體生成等。為了探討蛻皮甾酮對2型糖尿病大鼠肝細胞胰島素信號轉導分子基因與蛋白表達的影響，2010年3～10月，我們在前期進行的蛻皮甾酮改善大鼠胰島素抵抗的實驗基礎上，應用免疫組化技術與RT-PCR方法分別檢測胰島素信號轉導分子胰島素受體底物2(IRS-2)的蛋白及mRNA表達水平，旨在探討蛻皮甾酮胰島素增敏的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡雄性Wistar大鼠42只，體質量130～170 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。普通飼料為我院實驗動物中心配制的常規飼料，總熱量為12.61 kJ/g;高脂飼料參照文獻［1］喂養前1周臨時配制，-20℃保存，總熱量為20.53 kJ/g。葡萄糖檢測試劑盒(氧化酶法，重慶醫科大學臨床學院檢驗科)，胰島素測定試劑盒(放免法，中國原子能研究院)，免疫組化染色試劑盒(北京中山生物技術有限公司)。PCR擴增儀(美國PE)，紫外分光光度計(日本島津制作所)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，MUVB-20凝膠成像分析系統(美國Ultralum公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 14只大鼠用普通飼料喂養(正常組);28只用高脂飼料喂養1個月后，空腹狀態下一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg誘導2型糖尿病大鼠模型［1］。第7天檢測空腹血糖(FPG)和胰島素(FINS)，以 FPG≥7.0 mmol/L、胰島素敏感性(采用鉗夾試驗評估)降低為成模標準。將造模成功的25只大鼠隨機分為模型組13只和治療組12只，分別給予高脂飼料喂養、高脂飼料+蛻皮甾酮灌胃治療。

1.2.2 肝細胞IRS-2蛋白檢測 大鼠喂養5周后，活體剪取肝臟左葉組織，迅速放入液氮中冷凍1 min，-80℃凍存。取冰凍肝臟組織在低溫冰凍切片機上連續切片8張，厚度約5 μm，丙酮溶液中浸泡15 min，蒸餾水沖洗，晾干，-20℃保存或直接進行免疫組化試驗。加入30%H2O21份+純甲醇50份中浸泡15～20 min，蒸餾水漂洗，抗原修復，滴加正常山羊血清封閉，滴加抗IRS-2(1∶500)，4℃過夜，PBS洗滌，滴加生物素化二抗(抗兔 IgG)，37℃水浴25 min，PBS洗滌2 min×3次，滴加試劑SABC 20 min(37℃)，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。以PBS代替IRS-2抗體作為陰性對照。

1.2.3 肝細胞 IRS-2 mRNA檢測 采用 RT-PCR法。引物設計:IRS-2:上游引物:5'-GGCCTCTGTGGAAAATGTCTC-3'，下游引物:5'-CTGTGGCTTCCTTCAAGTGATG-3';內參照 GAPDH:上游引物:5'-GATGCTGGTGCTGAGTATGACG-3'，下游引物:5'-GTGGTGCAGGATGCATTGCTCTGA-3'，擴增片段長度為200 bp;內參照 β-actin:上游引物:5'-CCAGAACCAACCGCGAGATGAC-3'，下 游 引 物:5'-AGGGTACATGGTGGTGCCAGAC-3'，擴增片段長度為587 bp。IRS-2 mRNA的表達量用擴增產物條帶的光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來表示。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蛻皮甾酮對大鼠肝組織IRS-2蛋白含量的影響 免疫組化結果顯示，IRS-2蛋白陽性染色部位在細胞質。定量分析結果顯示，正常組、治療組、模型組的 IRS-2 蛋白含量分別為 4.90 ±0.29、3.80 ±0.30、2.43 ±0.36，正常組和治療組顯著高于模型組(t=19.70、10.29，P 均 ＜0.05)。

2.2 蛻皮甾酮對大鼠肝組織IRS-2 mRNA表達的影響 正常組、治療組與模型組的IRS-2 mRNA表達量分別為0.52 ±0.05、0.43 ±0.03、0.27 ±0.02，正常組和治療組顯著高于模型組(t=16.78、15.84，P 均 ＜0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠肝細胞IRS-2 mRNA表達情況比較

3 討論

正常胰島素生理功能的發揮首先通過與靶組織細胞膜表面的胰島素受體α亞基相結合，誘發β亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化，同時激活β亞基內在的酪氨酸蛋白激酶，進而引起胰島素受體的多個酪氨酸殘基磷酸化，后者再與含有SH2結構域的多種蛋白結合來調節細胞的生長、分化和代謝。當上述信號轉導途徑中任一環節發生改變，都可引起機體的胰島素抵抗，因此胰島素抵抗實質是胰島素信號轉導的缺陷［2］。

胰島素抵抗可發生在胰島素受體水平或受體后水平［3］。肝臟組織是機體利用葡萄糖的主要組織，也是2型糖尿病發生胰島素抵抗的主要部位之一。胰島素抵抗在2型糖尿病的發生、發展中起關鍵作用，因此，直接針對提高胰島素敏感性的藥物近年來倍受關注。目前首推胰島素增敏劑噻唑烷二酮類(格列酮類)藥物。經動物糖尿病模型及離體肝、肌、脂肪細胞株研究證實，該類藥能提高肌、脂肪細胞對葡萄糖的攝取及利用，抑制肝葡萄糖輸出，在2型糖尿病的治療史上具有重要意義。前期研究已證實，蛻皮甾酮在體外有降糖作用［4］，且對IR細胞具胰島素增敏作用［5］，但蛻皮甾酮如何促進肝細胞的葡萄糖攝取目前尚不清楚。本課題組體外實驗的研究結果表明，蛻皮甾酮在一定程度上可以阻止胰島素抵抗的形成及發展。

IRS-2是胰島素受體的一個重要底物。正常情況下，IRS-1在胰島素信號傳遞中起主要作用，但在IRS-1缺乏的動物只引起輕度胰島素抵抗，是由于此時 IRS-2代償了 IRS-1的作用［6］。當 IRS-1和IRS-2同時缺乏，則引起明顯的胰島素抵抗、產生嚴重的糖尿病，同時伴有胰島素分泌的削弱［7］。在胰島素代謝效應方面，促進肌肉和脂肪組織攝取、利用葡萄糖以IRS-1為主，IRS-2為次;而促進肝臟糖原合成和抑制肝臟葡萄糖輸出則以IRS-2為主，IRS-1為次。IRS-2在維持糖代謝平衡［8］及IRS-2缺陷對2型糖尿病的發生發展有著比IRS-1更為重要的作用［9］。

研究證實，胰島素信號轉導通路異常可引起胰島素抵抗。由于胰島素刺激葡萄糖轉運的信號轉導途徑中存在多個調控點，這些信號轉導分子已成為2型糖尿病治療的靶點［10～13］。本研究觀察了蛻皮甾酮對胰島素抵抗大鼠模型HepG2細胞胰島素信號轉導的IRS-2水平的影響，結果顯示，蛻皮甾酮顯著增加了肝細胞IRS-2蛋白的表達。提示蛻皮甾酮的胰島素增敏作用可能與IRS-2蛋白的表達增強有關。

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