健脾解毒方逆轉大腸癌細胞多藥耐藥的作用機制

李先茜，吳嘉熙，范忠澤，孫燕妮，高 虹

(1上海市徐匯區中心醫院，上海200031;2上海中醫藥大學附屬普陀醫院)

多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞對一種化療藥 物產生耐藥性后，對從未使用過的、結構和機制不同的多種化療藥物也產生交叉耐藥性［1］，是導致化療效果差的主要原因［2］。MDR與MDR基因MDR-1的過度表達導致腫瘤細胞內MDR-1編碼產物P-糖蛋白(P-gp)增多有關［3］，因此通過藥物影響MDR-1的表達來消除腫瘤細胞對化療的耐藥性，可增加化療效果［4］。研究發現，對晚期大腸癌患者加用健脾解毒方后，其化療效果明顯增強。2004年1月～2013年12月，我們觀察了健脾解毒方對大腸癌MDR基因表達的影響，檢測用藥前后腫瘤細胞內信號因子Akt磷酸化的改變，探討健脾解毒方逆轉大腸癌MDR基因的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 體質量約250 g的SD大鼠20只，大腸癌細胞敏感株(HCT-8)及耐藥株(HCT-8/V)購于南京凱基生物科技發展有限公司，PI3K抑制劑LY294002 購自Cell Signaling Technology，Inc(Danvers，MA，USA)，健脾解毒方(由生黃芪、黨參等11味中藥組成)購于上海中醫藥大學附屬普陀醫院中藥房，長春新堿(VCR)購自深圳萬樂藥業有限公司，抗p-Akt抗體購自SANTA公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清配制［3］與細胞培養 將大鼠隨機分為藥物組和對照組各10只，分別給予健脾解毒方劑和生理鹽水連續灌胃5 d，腹主動脈取血，分離血清。藥物組血清應用對照組血清分別配制成0%(空白血清)、5%、10%、15%、20% 的藥物血清，－20℃保存備用。HCT-8和HCT-8/V細胞加入含10%小牛血清的RPMI1640高糖培養基，置37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中常規培養。當細胞貼壁并覆蓋培養皿底80%后，用0.25%胰酶消化，每3～4 d傳代1次。

1.2.2 細胞生長抑制實驗 取對數生長期細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液配制成單個細胞懸液，調整細胞濃度至1×105/mL，以100 μL/孔接種于96孔培養板，置5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中預培養24 h后，分別加入100 μL含5%、10%、15%、20%健脾解毒方的藥物血清，以及空白血清+10 mol/L LY294002組，20%藥物血清+10 mol/L LY294002組，對照組為不含藥物的等體積空白血清。分別培養24、48、72 h，每組每個時間點設5個復孔。實驗組于相應時間點分別加入100 μL長春新堿(終濃度20 g/mL)，對照組加入等量生理鹽水。繼續培養24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察，并進行MTT比色實驗，于酶標儀570 nm處檢測吸光度A值，以空白組平均值調零，計算細胞生長抑制率:抑制率(%)=［(1－實驗孔平均A值)/對照孔平均A值］×100%。

1.2.3 實時熒光定量 PCR法檢測 MDR-1 mRNA表達 取對數生長期細胞，分為空白血清組、20%藥物血清組、空白血清+10 mol/L LY294002組、20%藥物血清+10 mol/L LY294002組培養48 h。按Trizol說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。MDR-1 mRNA上游引物:AAAAAGATCAACTCGTACCACTC，下游引物:GCACAAAATACACCAACAA;βactin上游引物:CTACGTCGCCCTGGACTTCGAGC，下游引物GATGGAGCCGCCGATCCACACGG。反應體系:100 ng/μL cDNA 1 μL，PCR 混合物 10 μL，上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，DNA polymerase 0.2 μL，DEPC-H2O 6.8 μL，總體積 20 μL。反應條件:94 ℃ 10 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min。反應結束后，記錄相關Ct值。使用未處理的HCT-8/V細胞的RNA作為標準品繪制標準曲線，求出各組MRD-1 mRNA的相對模板數，以β-actin作為內參。

1.2.4 Western blot方法測定 P-gp 及磷酸化 Akt蛋白(p-Akt)［6］取對數生長期細胞，分為空白血清組、20%藥物血清組、空白血清+10 mol/L LY294002組、20%藥物血清+10 mol/L LY294002組，培養48 h。PBS沖洗，加入細胞裂解液，離心取上清，蛋白定量后分別取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95℃變性10 min。12%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，電轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，依次加入一抗、二抗，室溫孵育2 h。TBST緩沖液洗滌，加入化學發光試劑，壓片，顯影，定影，照相。使用抗MDR-1兔多克隆抗體檢測MDR-1蛋白，抗p-Akt鼠單克隆抗體檢測p-Akt。

1.2.5 統計學方法 應用 PEMS3.1醫學統計軟件，結果以±s表示。多樣本比較以單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用直線相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞生長抑制率比較 見表1。長春新堿對HCT-8/V的生長抑制作用與健脾解毒方的藥物血清濃度及作用時間呈正相關。使用LY294002預處理HCT-8/V后，長春新堿的細胞生長抑制率增高了4～6倍;聯合使用20%藥物血清和LY294002后，長春新堿的生長抑制率增高了5～8倍(P均＜0.01)。

2.2 MDR-1 mRNA在大腸癌細胞中的表達 見表2。MDR-1 mRNA在HCT-8/V中的相對表達量較HCT-8明顯增高(P＜0.01)。使用20%的藥物血清預處理 HCT-8/V 細胞24、48、72 h，MDR-1 mRNA 在HCT-8/V中的相對表達量明顯降低(P＜0.01)。在相同的作用時間里，HCT-8/V中MDR-1 mRNA表達水平與藥物血清濃度呈線性反比關系，使用同一藥物血清濃度預處理細胞，MDR-1 mRNA表達量和作用時間呈線性反比關系。使用LY294002預處理細胞24、48、72 h，HCT-8/V 中 MDR-1 mRNA 表達較空白血清明顯降低(P均＜0.01)。

表1 藥物血清與LY294002對細胞生長抑制率的影響(n=5，%，±s)

表1 藥物血清與LY294002對細胞生長抑制率的影響(n=5，%，±s)

注:與同組空白血清比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 HCT-8空白血清比較，#P ＜0.01

組別 細胞生長抑制率24 h 48 h 72 h HCT-8細胞空白血清 60.0 ±2.4 65.0 ±2.5 63.0 ±3.1 20%藥物血清 57.0 ±2.1 59.0 ±3.2 67.2 ±2.7 HCT-8/V細胞空白血清 3.2 ±0.4# 3.7 ±0.3# 3.7 ±0.5#5%藥物血清 3.8 ±0.2 5.7 ±0.3* 8.0 ±0.7＊＊10%藥物血清 4.1 ±0.4* 8.2 ±0.4＊＊11.0 ±0.5＊＊15%藥物血清 4.8 ±0.5* 9.8 ±0.3＊＊12.3 ±0.6＊＊20%藥物血清 5.9 ±0.4＊＊11.0 ±1.1＊＊15.0 ±0.8＊＊空白血清 +LY294002 13.0 ±1.1*19.0 ±0.3*25.0 ±1.2*20%藥物血清 +LY294002 16.0 ±0.6*23.0 ±0.7*31.0 ±1.1*

表2 藥物血清與LY294002對大腸癌細胞MDR-1 mRNA 表達的影響(n=3，±s)

表2 藥物血清與LY294002對大腸癌細胞MDR-1 mRNA 表達的影響(n=3，±s)

注:與同組空白血清比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 HCT-8空白血清比較，#P ＜0.01

組別MDR-1 mRNA 表達24 h 48 h 72 h HCT-8細胞空白血清 10.2 ±2.4 15.1 ±1.5 13.0 ±2.2 20%藥物血清 11.0 ±1.1 12.0 ±3.0 14.0 ±2.3 HCT-8/V細胞空白血清 75.2 ±2.4# 78.1 ±1.5# 77.0 ±2.2#5%藥物血清 57.1 ±1.3* 51.7 ±1.3* 48.0 ±2.7*10%藥物血清 54.1 ±3.4* 46.1 ±1.4* 41.0 ±1.5＊＊15%藥物血清 44.8 ±2.5* 39.8 ±2.3＊＊ 32.3 ±1.6＊＊20%藥物血清 35.9 ±2.2＊＊ 31.0 ±1.2＊＊ 25.0 ±1.2＊＊空白血清+LY294002 23.0 ±3.1＊＊ 19.0 ±3.1＊＊ 15.0 ±1.1＊＊20%藥物血清 +LY294002 16.0 ±2.2＊＊ 13.0 ±1.8＊＊ 11.0 ±1.2＊＊

2.3 健脾解毒方對大腸癌細胞P-pg蛋白表達及p-Akt的影響 P-pg在HCT-8/V中的相對表達量明顯高于 HCT-8。應用健脾解毒方藥物血清和LY294002預處理HCT-8/V細胞48 h，P-pg表達均下降，二者聯合預處理HCT-8/V細胞48 h，MDR-1 mRNA和 P-pg蛋白均明顯下降(P均 ＜0.05)。20%藥物血清處理HCT-8/V細胞48 h后，細胞內p-Akt表達水平無明顯改變，使用LY294002處理細胞后，p-Akt明顯下降，藥物血清與LY294002聯合處理HCT-8/V，兩者在降低p-Akt上呈現協同效應。見表3。

表3 藥物血清及LY294002對人結腸直腸腺癌細胞中P-gp 蛋白表達及 p-Akt的影響(n=3，±s)

表3 藥物血清及LY294002對人結腸直腸腺癌細胞中P-gp 蛋白表達及 p-Akt的影響(n=3，±s)

注:與同組空白血清比較，*P＜0.05;與 HCT-8空白血清比較，△P ＜0.05

組別P-gp p-Akt HCT-8細胞空白血清 22.1 ±2.0 9.3 ±1.4 20%藥物血清 25.1 ±1.5 8.9 ±0.8 HCT-8/V細胞空白血清 64.1 ±2.2△ 77.0 ±2.1△20%藥物血清 34.2 ±1.8* 18.0 ±0.9*空白血清 +LY294002 29.0 ±1.0* 14.0 ±1.1*20%藥物血清 +LY294002 12.7 ±0.8* 10.0 ±0.7*

3 討論

中醫學認為，大腸癌是由毒邪損傷腸絡、痰瘀凝聚腸道及正氣不足所致，其病機以脾胃虛弱為本，瘀毒內結為標，治則為健脾化瘀解毒。健脾解毒方具有健脾解毒活血之功效，用于治療大腸癌已取得一定效果。

MDR是常見的化療耐藥現象，這種耐藥性多針對各種天然來源的親脂性藥物，包括長春新堿、蒽環類、表鬼臼毒素類、放線菌素D、絲裂霉素、秋水仙堿以及紫杉醇等［7］。化療藥物與細胞膜上的P-gp結合后，ATP結合區被活化水解釋放能量，藥物尚未發揮抗腫瘤作用時，水解釋放能量將抗腫瘤藥物從細胞膜內向膜外的轉換，細胞膜內藥物濃度降低，達不到抗腫瘤效果，產生耐藥性。目前，臨床一般通過藥物影響MDR-1的表達來消除腫瘤細胞對化療的耐藥性，增加腫瘤化療的有效性。研究顯示，健脾解毒方可降低腸癌患者外周血MDR1 mRNA和CK20 mRNA，調節P-gp［5］。本研究發現，健脾解毒方能有效提高大腸癌耐藥細胞株對長春新堿的藥物敏感性，而且藥物敏感性的提高與藥物作用時間及藥物劑量呈正相關。同時發現健脾解毒方與PI3K抑制劑LY294002聯合用藥對提高耐藥腫瘤細胞的藥物敏感性具有協同效應。

有關MDR的發生機制中，研究最多的是P-gp介導的多藥耐藥。P-gp是由MDR-1基因編碼的跨膜糖蛋白，分子量為170 kD，由1 280個氨基酸組成［8］。P-gp能與抗癌藥物結合，將藥物從胞內泵出胞外，隨著抗癌藥物在細胞內濃度的不斷下降，藥物的細胞毒作用逐漸減弱甚至消失，從而無法有效殺傷腫瘤細胞而引起 MDR［9］。

目前逆轉惡性腫瘤耐藥性的藥物逆轉劑主要有針對P-gp的逆轉劑，共包括3代。第1代P-gp抑制劑包括鈣離子拮抗劑、鈣通道阻滯劑、免疫抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、抗生素和表面活性劑等。第2代P-gp抑制劑主要有4種:右維拉帕米、右尼古地平、PSC833和 VX710。第 3代 P-gp抑制劑包括XR9576、Tariquidar、R101933 等［10］;谷胱甘肽-S-轉移酶GST介導的逆轉劑，如丁硫氨酸亞砜胺、硝基咪唑類［3］;針對MRP的逆轉劑;針對肺耐藥蛋白的逆轉劑、DNA拓撲異構酶Ⅱ(TopoⅡ)有關的逆轉劑;核酶逆轉MDR、MDR反義寡核苷酸逆轉、RNA干擾、腫瘤基因工程疫苗等基因治療。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)重要的下游直接效應分子，具有調控細胞的大小、生長、增殖、存活以及糖代謝等重要作用。Akt可在PI3K作用下磷酸化，形成p-Akt。p-Akt可通過cAMP反應元件結合蛋白上調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達從而抑制細胞調亡;還有研究提示，p-Akt能直接抑制caspase-9的活性，從而阻斷其介導的caspase級聯反應，抑制細胞凋亡。另外，p-Akt還能通過調控轉錄因子家族NF-κB和P53的作用影響細胞存活。

Akt是PI3K下游作用的靶蛋白，是PI3K/Akt信號轉導通路的核心，可被很多生長因子激活，進而通過抑制凋亡和調節細胞增殖在腫瘤的發生以及耐藥中起重要作用。Akt在P13K或缺氧微環境的刺激下發生磷酸化，激活的Akt從細胞質募集至胞膜或轉位到胞核，使底物蛋白特定部位的絲氨酸、蘇氨酸磷酸化。p-Akt通過抑制凋亡促進細胞的存活，在腫瘤的發生中起重要作用。

目前國內關于中藥逆轉MDR的體外實驗已取得一定進展。本研究觀察了健脾解毒方逆轉大腸癌多藥耐藥基因中PI3K/Akt信號通路的動態變化，并觀察阻斷PI3K/Akt信號通路對健脾解毒方逆轉大腸癌MDR基因的影響，從PI3K/Akt信號角度探討該方逆轉MDR的機制。結果顯示，健脾解毒方對大腸癌MDR有逆轉作用，在逆轉大腸癌MDR基因的調控中，可以逆轉大腸癌MDR-1的同時，伴隨著p-Akt的變化。推測健脾解毒方逆轉大腸癌MDR基因過程中，可能通過 PI3K/Akt信號通路調控MDR基因的表達，從而逆轉腫瘤MDR，為中醫健脾解毒治法治療大腸癌提供了實驗依據。

［1］Dubey Al，Min JW，Koo HJ，et al.Anticancer potency and multidrug-resistant studies of self-assembled arene-ruthenium metallarectangles［J］.Chemistry，2013，19(35):11622-11628.

［2］Plisson F1，Huang XC，Zhang H，et al.Lamellarins as inhibitors of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in a human colon cancer cell line［J］.Chem Asian J，2012，7(7):1616-1623.

［3］許建華，范忠澤.MDR1/P-gp與大腸癌耐藥及中醫藥研究概況［J］.安徽中醫學院學報，2004，23(5):57-58.

［4］Eid SY，El-Readi MZ，Eldin EE，et al.Influence of combinations of digitonin with selected phenolics，terpenoids，and alkaloids on the expression and activity of P-glycoprotein in leukaemia and colon cancer cells［J］.Phytomedicine，2013，21(1):47-61.

［5］Spengler G，Handzlik J，Ocsovszki I，et al.Modulation of multidrug efflux pump activity by new hydantoin derivatives on colon adenocarcinoma cells without inducing apoptosis［J］.Anticancer Res，2011，31(10):3285-3288.

［6］F.M.奧斯伯［美］.精編分子生物學實驗指南［M］.北京:科學出版社，2005:665-667.

［7］Jeon YH1，Bae SA，Lee YJ，et al.Evaluation of the reversal of multidrug resistance by MDR1 ribonucleic acid interference in a human colon cancer model using a Renilla luciferase reporter gene and coelenterazine［J］.Mol Imaging，2010，9(6):343-350.

［8］Zhang YF，Li XH，Shi YQ，et al.CIAPIN1 confers multidrug resistance through up-regulation of MDR-1 and Bcl-L in LoVo/Adr cells and is independent of p53［J］.Oncol Rep，2011，25(4):1091-1098.

［9］Schumacher U，Nehmann N，Adam E，et al.MDR-1-overexpression in HT 29 colon cancer cells grown in SCID mice［J］.Acta Histochem，2012，114(6):594-602.

［10］Bai F1，Wang C，Lu Q，et al.Nanoparticle-mediated drug delivery to tumor neovasculature to combat P-gp expressing multidrug resistant cancer［J］.Biomaterials，2013，34(26):6163-6174.