小四五顆粒對糖尿病腎病大鼠血漿蛋白質圖譜的影響

魏 敏，孫曉敏，羅 仁，柳志偉，鄭雪花

(1福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州350122;2南方醫科大學中醫藥學院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴重的并發癥之一，是導致終末期腎病(ESRD)的主要病因［1］。臨床上應用中藥小四五顆粒治療DN已取得良好療效。2013年4～12月，我們對DN大鼠模型給予小四五顆粒，觀察其血漿蛋白質圖譜的變化差異，旨在從蛋白質分子水平闡明DN的發病機制及小四五顆粒治療DN的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料 選用SPF級Wistar雄性大鼠24只，體質量200～280 g，鼠齡3個月左右，由南方醫科大學動物實驗中心供應。小四五顆粒劑(柴胡、黃芩、半夏、人參、白術、茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、熟地黃、白芍、當歸、川芎、甘草等)由南方醫科大學中醫藥學院制劑室制成顆粒劑，臨用前配成混懸液。硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、甲醛、硝酸銀、乙醇、冰醋酸、醋酸鈉、甘氨酸均為天津大茂化學試劑廠試劑，藥物STA、血漿去高豐度蛋白試劑盒購自Sigma公司，等電聚焦儀、垂直電泳儀及其配件均為Bio-Rad公司配套儀器，圖像分析軟件為 Image Master 2D platinum 5.0。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 大鼠適應性喂養1周后，禁食12 h，隨機分為模型組、治療組、正常對照組各8只。模型組和治療組腹腔注射65 mg/kg STZ，72 h后尾靜脈取血測血糖，以血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病模型成功，2周后測微量白蛋白、血糖，高于正常值者為DN造模成功。造模成功后，治療組給予小四五顆粒1.8 g/kg(按照人與大鼠體表面積換算，相當于成人20 g/d)灌胃，模型組與正常對照組給予等體積生理鹽水灌胃，均1次/d，連續4周。

1.2.2 蛋白定量檢測 處死大鼠，腹主動脈取血，4℃離心10 min，取上層血漿，EP管 100 μL/管分裝后，－80℃保存備用。采用Bradford法進行蛋白定量，取5、10、15、20、25、30、35 μg 的 BSA 制作標準曲線，樣品取3 μL，雙復管測定。每管加入1 mL Bradford染色，渦旋振蕩20 s，充分混勻，測定吸光度值。

1.2.3 雙向凝膠電泳檢測 取100 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，總體積460 μL，參考文獻［2］和儀器操作手冊進行等電聚焦、SDS-PAGE凝膠電泳，硝酸銀染色，掃描凝膠圖像，使用PD-Quest分析軟件進行圖像分析，其過程包括斑點檢測、量化、背景消減和匹配，蛋白斑點的差異分析，選取表達量相差2倍以上為差異表達范圍。

2 結果

2.1 蛋白定量檢測結果 正常對照組、模型組、治療組的血漿蛋白平均濃度分別為 4.87、4.79、4.80 μg/μL。

2.2 雙向凝膠電泳檢測結果 見圖1。與正常對照組相比，模型組血漿蛋白質銀染雙向凝膠電泳圖譜中高表達的蛋白質斑點54個，低表達的蛋白質斑點19個;治療組血漿蛋白質銀染雙向凝膠電泳圖譜中高表達的蛋白質斑點43個，低表達的蛋白質斑點14個，有16個較模型組明顯恢復。

圖1 雙向凝膠電泳圖譜

3 討論

小四五顆粒由東漢張仲景《傷寒論》中的小柴胡湯、五苓散及宋代《太平惠民和濟局方》中的四物湯三方組成，其中小柴胡湯疏通三焦、理氣和解，五苓散通陽化氣、利水滲濕，四物湯養血活血祛瘀，全方脾腎雙補、攻補兼施、陰陽相濟，可行氣祛瘀、升清降濁。研究表明［3，4］，小四五顆粒具有與 ACEI相當的改善腎內血流動力學異常的作用，并可減少尿蛋白排泄，延緩慢性腎病的進程。我們的前期研究顯示，小四五顆粒對DN大鼠模型具有防治作用，能夠降低血脂和血糖，調節腎素—血管緊張素系統(RAS)基因表達，在一定程度上阻止腎小球硬化，延緩 DN 進展，并有一定的逆轉作用［5～7］。

雙向電泳由O'Farrell［8］最早建立于20世紀70年代，其基本原理為:第1向基于蛋白質的等電點不同在梯度膠內等電聚焦(IEF)，第2向則根據分子量大小運用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)不同進行分離，把復雜蛋白質混合物中的蛋白質在二維平面上分開。雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的核心技術，該技術廣泛用于臨床疾病的研究中［9～11］。腎病中的蛋白尿治療非常棘手，其產生可能是由于一個或多個血漿因子滲透導致腎小球濾過膜通透性增高而致蛋白滲出。Candiano等［12］利用2-DE技術從FSGS小鼠血清中檢測出50個蛋白質點，均能改變血清白蛋白通透性，其中對白蛋白通透性有抑制作用的5種蛋白質為高密度脂蛋白復合體、高分子量J與L，以及一個28 kD片段A-IV。上述研究提示，血漿中存在改變腎小球濾過膜通透性的因子，這可以闡明DN蛋白尿的發生機制。血漿取材容易、富含蛋白質，其蛋白水平的變化與多種疾病有關。觀察血漿中蛋白質的改變情況，可為疾病的診斷、治療和預后提供全面的信息。本實驗通過建立DN大鼠模型，給予中藥小四五顆粒干預，應用蛋白組學實驗技術，從分子水平觀察血漿蛋白質銀染雙向凝膠電泳圖譜的變化。結果顯示，與正常對照組相比，模型組電泳圖譜中高表達的蛋白質斑點54個、低表達的蛋白質斑點19個、治療組高表達的蛋白質斑點43個、低表達的蛋白質斑點14個，治療組上述差異表達的蛋白質斑點有16個較模型組明顯恢復。因此推測，16個差異表達的蛋白質斑點可能與DN的發生發展密切相關，在后續實驗中，我們將進一步深入研究這些蛋白質斑點，明確相關的差異蛋白。

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