厄洛替尼對胰腺癌細胞侵襲力的影響及機制

于錦萍，石國剛，張秀艷，王 林，陳 紅，房 芳

(1唐山市工人醫院分院，河北唐山063000;2遵化市人民醫院;3河北聯合大學附屬醫院;4唐山市工人醫院)

胰腺癌術后轉移是胰腺癌手術切除治療的難點。研究顯示，胰腺癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)的陽性率接近50%，其參與了胰腺癌的發生、發展和轉移［1］。2003～2008年，我們觀察了厄洛替尼對胰腺癌細胞生長、侵襲的影響及其相關因子核轉錄因子NF-κB的表達變化。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株PANC-1購自中國科學院上海細胞生物學研究所。MTT購于美國Sigma aldrich公司，RAD001用二甲基亞砜(DMSO)配制成1 mmol/L貯備液，實驗時用RPMI1640培養液稀釋至所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測細胞增殖情況 調節PANC-1細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養板中，根據厄洛替尼的藥物濃度分為0、5、25、50 μmol/L四個濃度組，每組設6個復孔，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 mL，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養液，每孔加入150 mL DMSO，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計算各組細胞生長抑制率，抑制率=［(空白對照組OD值－各實驗組OD值)/空白對照組OD值］×100%。

1.2.2 Transwell檢測細胞侵襲力 實驗分為空白對照組、EGF(表皮生長因子)組、厄洛替尼組、EGF聯合厄洛替尼組。EGF、厄洛替尼作用濃度分別為10 ng/mL、4 μmol/L，聯合組為 EGF 先作用 24 h 后再加厄洛替尼作用4 h。分別收集各處理組的PANC-1細胞培養上清液，置于8 μm孔徑的 Transwell板中，于半透膜上層加入2×105PANC-1細胞系。4 h后于顯微鏡下計數每個高倍視野平均細胞數。

1.2.3 Western blot檢測 NF-κB 蛋白表達 收集各組細胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度后 －80℃保存備用。SDS-PAGE電泳分離，完畢后將蛋白轉移到PVDF膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的TBST溶液，4℃過夜，洗膜，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫反應1 h，目標蛋白質用DAB顯色。計算機掃描，以GAPDH蛋白做參照，分析處理。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，結果以±s表示，組間比較采用兩樣本均數的t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度厄洛替尼對PANC-1細胞生長的影響 PANC-1細胞生長抑制率隨厄洛替尼濃度增加明顯升高，并且各個濃度的細胞抑制率差別均有統計學意義(P均＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度厄洛替尼對PANC-1細胞的生長抑制率比較

2.2 厄洛替尼對PANC-1細胞侵襲力影響 Transwell試驗結果提示，對照組、EFG組、厄洛替尼組、EGF+厄洛替尼組的PANC-1細胞數分別為(57.0±12.79)、(167.4 ±12.32)、(56.2 ±7.97)、(167.4±12.32)個，厄洛替尼組和EGF+厄洛替尼組與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 厄洛替尼對NF-κB表達的影響 Western blot結果顯示，對照組、EFG組NF-κB蛋白表達量升高;厄洛替尼組、EGF+厄洛替尼組降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

圖1 Western blot檢測各組NF-κB表達

3 討論

胰腺癌早期很難發現，臨床確診時多為晚期，僅10% ～20%的患者有手術根治切除的機會［2，3］。進展期胰腺癌的治療目前尚無理想的化療藥物，腫瘤細胞的快速增生、轉移及對放化療抵抗仍是目前胰腺癌治療的難點［4］。侵襲和轉移是胰腺癌患者死亡的主要原因，EGFR在這一過程中起重要作用［5］。EGFR與配體結合后發生二聚化，隨后受體二聚體內發生自身磷酸化和轉磷酸化作用，使羧基端特異性的酪氨酸殘基磷酸化，進而調節細胞的生長、分化和增殖等［6］。厄洛替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要通過與三磷酸腺苷競爭結合至EGFR胞內酪氨酸激酶功能域，抑制受體自磷酸化而阻止下游信號傳導，從而抑制細胞周期進程，加速細胞凋亡，抑制血管生成，發揮抗腫瘤作用［7］。本研究結果顯示，厄洛替尼可以抑制胰腺癌的生長，并呈濃度依賴性，其抑制作用隨濃度增加而增強。

NF-κB因子廣泛存在真核生物中，是一種重要的細胞內信號因子，其結構是由P50和P65組成的二聚體，調節許多與細胞生長和分化相關的基因表達［8，9］。它作為信號傳導途徑中的樞紐，與機體免疫和腫瘤的發生發展、細胞凋亡的調節以及胚胎發育等有密切聯系［10］，是重要的核轉錄因子。研究表明，胰腺癌組織有較高的NF-κB活性及表達，這種高表達與胰腺癌的進展密切相關［11］。同時有研究證實，使用NF-κB抑制劑可以阻斷NF-κB P65的表達及 NF-κB 的 DNA 結合活性［12］。張浩等［13］研究認為，EGF可通過上調NF-κB的表達促進胰腺癌細胞的侵襲能力。本研究發現，EGF可以上調NF-κB的表達，應用厄洛替尼處理后的胰腺癌PANC-1細胞增殖明顯受到抑制，并且能夠明顯下調NF-κB活性。提示厄洛替尼可通過抑制EFG介導的NF-κB的活化，發揮其抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲的作用。

綜上所述，厄洛替尼可通過抑制 NF-κB的表達，抑制胰腺癌細胞的侵襲力，可以用做胰腺癌的一線治療。本實驗從分子水平為其抗腫瘤浸潤提供了實驗依據。

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