銀杏復(fù)方湯劑對家兔腎臟缺血再灌注損傷模型腎組織的保護作用及機制

成月英，苑 磊，李曉東，郭紅偉

(保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000)

腎缺血再灌注可引起腎小管損傷、缺血、壞死，腎功能嚴重受損，導(dǎo)致腎功能衰竭。缺血再灌注損傷中由于氧自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性抑制，導(dǎo)致氧自由基大量堆積，細胞受到破壞;丙二醛(MDA)可引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細胞生物膜通透性增高［1，2］，引起腎缺血再灌注損傷的腎小管上皮細胞變形、壞死，進而導(dǎo)致腎功能異常。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)是一種炎癥介質(zhì)，亦參與了腎缺血再灌注的損傷。2011年6月～2012年5月，我們觀察了銀杏復(fù)方湯劑對家兔腎臟缺血再灌注損傷模型腎組織MDA、SOD、GSH-Px及 ICAM-1表達的影響，探討銀杏復(fù)方湯劑對缺血再灌注損傷腎組織的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康日本大耳白兔30只，雌雄不分，體質(zhì)量1 000～1 500 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)場提供。隨機分為對照組、再灌注組和治療組各10只。銀杏復(fù)方湯劑的組成為銀杏葉18 g、燈盞花12 g、黃芪5 g，用清水漂洗、蒸餾水浸泡30 min后常規(guī)煎煮，煮沸30 min，濾掉藥渣，藥液冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 對照組與再灌注組給予等量生理鹽水灌胃，治療組給予銀杏復(fù)方湯劑12 mL/kg、1次/d灌胃，共42 d。于最后1次灌胃1 h后手術(shù)。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿腹部正中線切口逐層分離暴露雙側(cè)腎臟，分離并切除右腎及腎蒂，游離及保護左腎及左腎蒂。對照組不夾閉左腎及左腎蒂，直接關(guān)腹;再灌注組與治療組均用動脈夾夾閉左側(cè)腎蒂1 h，松夾重新灌注，關(guān)腹。術(shù)中夾閉左側(cè)腎蒂可見腎臟迅速由鮮紅變紫黑，松開動脈夾后恢復(fù)血流灌注，可見腎臟迅速由紫黑色變?yōu)轷r紅，為模型制作成功。

1.2.2 檢測方法 各組均于再灌注1 h后處死，取缺血腎組織用10%中性甲醛固定。①腎組織學(xué)改變:取腎組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成3 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察腎間質(zhì)小管結(jié)構(gòu)變化。②腎組織ICAM-1表達:取腎組織石蠟切片，應(yīng)用免疫組化法檢測腎組織ICAM-1表達，以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，未著色為陰性。先于光鏡下判定有無陽性表達，然后采用計算機圖像灰度分析測定平均灰度值。③脂質(zhì)過氧化損傷指標(biāo)測定:使用SOD、GSH-Px、MDA試劑盒，采用硫代巴比妥酸(TBM)法比色和黃嘌呤氧化法測定腎組織中MDA含量和SOD、GSH-Px活性。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS14.0、SPSS16.0 統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎小管組織形態(tài)學(xué)改變 對照組腎小管間質(zhì)病變輕微，腎小管輪廓清晰可見，腎小管上皮細胞排列規(guī)整，腎間質(zhì)無明顯炎性細胞浸潤;再灌注組小管間質(zhì)病變較重，腎小管上皮細胞排列紊亂、部分細胞腫脹變性，腎間質(zhì)充血水腫，少量炎性細胞浸潤;治療組較再灌注組腎小管上皮細胞排列稍整齊，上皮細胞腫脹變性減輕，腎間質(zhì)充血、水腫好轉(zhuǎn)。

2.2 各組腎組織ICAM-1、MDA、SOD、GSH-Px比較治療組ICAM-1表達、MDA含量明顯低于再灌注組，SOD、GSH-Px活性明顯高于再灌注組(P均＜0.05)，治療組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均＞0.05)。見表1。

表1 各組腎組織中ICAM-1、MDA和SOD、GSH-Px 比較(±s)

表1 各組腎組織中ICAM-1、MDA和SOD、GSH-Px 比較(±s)

注:與再灌注組比較，*P ＜0.05

組別 n ICAM-1 MDA(mmol/g)SOD(U/g)GSH-Px［U/(mg·prot )］對照組 10 9.38 ±1.05 3.412 ±0.701 28.120 ±2.108 67.176 ±3.212再灌注組 10 35.21 ±1.75 6.702 ±1.611 21.091 ±1.715 23.092 ±1.891治療組 10 10.83 ±1.19* 4.422 ±1.312*29.710 ±1.124*52.108 ±1.492*

3 討論

腎缺血再灌注損傷的機制復(fù)雜，與氧自由基生成過多、細胞內(nèi)鈣超載、中性粒細胞及補體系統(tǒng)活化、細胞凋亡、脂類參與、一氧化氮、內(nèi)皮素等因素有關(guān)，是一個多因素參與的病理生理過程。其中氧自由基在腎缺血再灌注損傷中起重要作用［3］。腎缺血再灌注損傷以腎小管損傷為主，其機制可能是:腎小管上皮細胞中的溶酶體被激活，釋放大量溶酶體酶于腎小管上皮細胞質(zhì)，導(dǎo)致上皮細胞刷狀腺脫落，上皮細胞結(jié)構(gòu)被破壞，細胞完整性消失，上皮細胞嚴重受損導(dǎo)致腎功能衰竭。腎小管細胞受損后釋放多種炎癥介質(zhì)及趨化因子，促進炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)纖維化形成，加重腎損害。本研究顯示，家兔腎缺血再灌注損傷后腎組織中SOD、GSH-PX活性下降，MDA含量升高，說明缺血再灌注過程中腎臟組織會產(chǎn)生大量氧自由基及脂質(zhì)過氧化物。

銀杏復(fù)方湯劑由銀杏葉、燈盞花和黃芪組成。銀杏葉的主要功效成分是黃酮醇類化合物和萜內(nèi)酯類化合物，具有擴張血管，改善腦循環(huán)，抑制血小板凝聚酶等作用，對腦血栓、心絞痛、心肌梗死有良好的治療作用［4，5］。動物實驗顯示，銀杏葉提取物能防止腦水腫模型大鼠腦缺血缺氧引起的氧化磷酸化脫偶聯(lián)反應(yīng)，保持細胞內(nèi)線粒體的正常功能，防止細胞內(nèi)Ca2+超載，保護損傷的腦細胞［6］;對阿爾茨海默病大鼠具有神經(jīng)保護作用［7］。燈盞花中含有還原性酚羥基，具有清除羥氧自由基、過氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用［8］。黃芪具有增強免疫功能、提高機體應(yīng)激及耐缺氧能力、促進機體代謝等功效。顧燕等［5］發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能提高大鼠腎組織中SOD活性，抑制腎皮質(zhì)中MDA含量，抑制脂質(zhì)過氧化，保護大鼠腎缺血再灌注損傷;賈孟良等［9］報道，銀杏葉提取物能減輕小鼠腎小管上皮細胞缺血性改變，保護小鼠腎臟急性缺血再灌注損傷，降低腎組織中MAD含量，保護腎臟。本研究顯示，銀杏復(fù)方湯劑干預(yù)組腎臟SOD、GSH-PX活性上調(diào)，MDA含量降低，說明其可減輕家兔腎臟缺血再灌注后的氧化應(yīng)激，保護腎臟。炎癥因子ICAM-1參與了腎缺血再灌注的損傷機制。正常情況下，ICAM-1在腎小球及腎小管細胞無表達，在腎組織嚴重缺血缺氧狀態(tài)下，ICAM-1能激活多種炎癥因子及炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致腎損傷［10］。本研究顯示，應(yīng)用銀杏復(fù)方湯劑使腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞中ICAM-1表達明顯降低，說明銀杏復(fù)方湯劑能抑制炎癥介質(zhì)釋放，從而保護缺血再灌注腎損傷。

綜上所述，銀杏復(fù)方湯劑能降低缺血再灌注損傷家兔的腎組織MDA含量，升高SOD、GSH-Px活性，顯著降低腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞ICAM-1表達，對家兔缺血再灌注損傷具有明顯保護作用。

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