TNF-α、MMP-2及VEGF在大隱靜脈曲張形成中的作用

張 陳，雷躍華，李 曦，馮會和，付召君，魏 健，楊玉輝，王 勇

(自貢市第四人民醫院，四川自貢643000)

大隱靜脈曲張血管形成是發生于曲張大隱靜脈中平滑肌細胞和細胞外基質等主要成分的結構改變，是靜脈血管壁組織系統適應來自各種病理狀態所發生的自身代償的結果。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)及血管內皮細胞生長因子(VEGF)在大隱靜脈的形成中具有重要作用。本研究通過檢測曲張大隱靜脈組織標本中TNF-α、MMP-2、VEGF 的表達，探討三者在大隱靜脈曲張形成中的作用。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1～12月我院收治的大隱靜脈曲張患者40例，男27例、女13例，年齡35～75歲、平均59歲。均符合《黃家駟外科學》(第8版)、《外科學》(第8版)中的診斷標準，排除有活動性下肢潰瘍并感染、深靜脈血栓，伴嚴重心、腦、肺疾病，伴糖尿病及其他系統感染者。根據曲張靜脈管壁厚度分為萎縮(管壁厚度＜409 μm)組17例，增生(管壁厚度≥409 μm)組23例。選擇同期需要移植使用的、外傷需截肢的15例正常大隱靜脈血管作為對照組，患者男9例、女6例，年齡15～72歲、平均51歲。

1.2 方法

1.2.1 標本制作及 TNF-α、MMP-2、VEGF 表達檢測

采用無損傷原則保護切取的靜脈血管標本(曲張靜脈切取明顯迂曲擴張部及擴張部中間之血管壁)，常規固定包埋，HE染色，切成5～8 μm厚的切片，組織切片完全脫蠟和水化后，用PBS沖洗。微波修復抗原，加過氧化物酶阻斷反應，非特異性動物血清封閉，再分別滴加一抗［TNF-α(1∶100)、MMP-2(1∶100)、VEGF(1∶100)］和生物素標記的二抗，室溫下孵育10 min后PBS沖洗。加鏈霉素菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，室溫下孵育10 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 評定標準 采用定位定性法，即定位在高倍鏡下觀察一張切片5個視野，取平均值，對染色強度和范圍進行定性分級，細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，細胞質顯色的不計數。觀察視野中100個細胞中的陽性細胞數。評定標準:細胞無著色為0分;細胞呈淡黃色，陽性細胞數≤25%，計1分;細胞深黃色，陽性細胞＞25% ～50%，計2分;細胞呈棕黃色，陽性細胞＞50%，計3分。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α、MMP-2、VEGF 在不同組織中的表達TNF-α、VEGF、MMP-2在曲張靜脈血管細胞核內呈棕黃色顆粒;在正常靜脈血管細胞中無著色，或細胞核內呈淡染棕黃色顆粒。

2.2 各組 TNF-α、VEGF、MMP-2 陽性表達情況比較 見表1。

3 討論

大隱靜脈曲張的形成主要原因是靜脈壁軟弱、靜脈瓣膜缺陷及靜脈內壓升高，TNF-α、MMP-2、VEGF在大隱靜脈的形成中具有重要作用。TNF-α具有廣泛的生物學作用，包括抗腫瘤、細胞免疫調節、細胞調亡、細胞毒性等。TNF-α主要由激活的巨噬細胞和某些腫瘤細胞合成，通過與其自身受體結合發生信號傳遞，促使細胞內蛋白磷酸化和脫磷酸化，激活NF-κB產生生物學效應。TNF-α高表達可引起組織細胞出血、壞死，還可與誘導炎性細胞因子的釋放、刺激異常血管增生。研究證實，TNF-α具有雙重的生物學作用［1］:正常水平的TNF-α可以調節免疫應答、抗感染、促進組織修復、引起細胞凋亡等，但大量產生和釋放則會破壞機體的免疫平衡，產生多種病理損傷。TNF-α能刺激其他細胞因子如IL-4、IL-6等釋放，擴大其效應，介導創傷后細胞炎性反應，促進靜脈曲張急性期蛋白的合成。這些介質導致細胞內皮損傷，誘導中性粒細胞分裂、遷移、黏附和浸潤，并可誘導其脫顆粒反應和溶酶體酶釋放，從而導致過度的炎癥反應，促使靜脈曲張形成或加重。

表1 各組TNF-α、VEGF、MMP-2陽性表達情況比較［例(%)］

MMP是降解細胞外基質的蛋白酶類家族中最重要的一類，存在于正常人體中，參與機體多種生理及病理過程，如傷口愈合、新生血管形成、腫瘤侵潤及轉移、炎癥反應等［2］。MMP-2定位于細胞穿透基質的突出上，其對血管內皮細胞的趨化、遷移和增生起關鍵作用。路艷等［3］發現，去除了MMP-2基因的小鼠角膜血管生長面積明顯小于對照組，表明MMP-2能促進新生血管形成。本研究結果顯示，MMP-2在正常靜脈組織中有一定表達，而在曲張靜脈組織中細胞質、細胞核都表達明顯，與文獻［4，5］報道相符。MMP-2的高表達可抑制蛋白酶的活性，有利于結締組織的沉積，從而增加靜脈壁的厚度［6，7］。因此判斷MMP-2對靜脈曲張的病理過程有重要推動作用。

VEGF是惟一作用于血管內皮細胞的生長因子，有很強的促進血管內皮細胞有絲分裂、內皮細胞增殖、遷移和增強血管通透性的作用［8～10］。其主要作用是刺激血管內皮細胞分泌蛋白酶和蛋白酶原活化因子，導致血管基底膜降解，細胞隨之進入周圍的基質，發生遷移、增生，形成一個新的血管形成區域。有學者發現，新生血管中 VEGF水平增高，認為VEGF是一個有效的內源性血管因子。VEGF通過與細胞膜上的 VEGF受體相結合發揮作用，而VEGF受體廣泛分布于血管內皮細胞中，因此，VEGF作為與血管病理生理改變過程相關的內源性生成因子［11］，對靜脈曲張的形成有促進作用。本研究顯示，VEGF在對照組和曲張組均有表達，在后者為高度表達，光鏡下提示VEGF在上皮、內皮細胞上都有表達，與文獻報道［12，13］一致。Meslri對 VEGF的表達作用進行干預，發現新生細胞逐漸衰退，調亡，說明VEGF是一種特異性促進血管內皮細胞有絲分裂、對血管細胞存活起主要調控作用的因子。

綜上所述，TNF-α、MMP-2、VEGF 在大隱靜脈曲張形成的病理過程中起到重要的免疫調節作用，對靜脈曲張的發生發展過程中起推動作用。

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