糞便標本中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在大腸癌早期篩查中的意義

張 虎，張 平，江 軍，李素迎，袁 林，齊 健，朱尤慶

(1武警湖北省總隊醫院，武漢430060;2武漢大學中南醫院;3湖北省腸病醫學臨床研究中心、湖北省腸病重點實驗室)

大腸癌(CRC)是胃腸道常見的惡性腫瘤，早期發現、早期診斷是降低CRC發病率、提高生存率的有效手段。目前常見的CRC篩查方式包括糞便潛血試驗、電子結腸鏡、仿真結腸鏡檢查等，這些檢查存在敏感性和特異性低、需要嚴格的腸道準備導致患者依從性差、對早期CRC的檢出率低等缺陷。表觀遺傳調控機制是一種可遺傳的基因功能調控方式，DNA異常甲基化的改變是表觀遺傳修飾的主要方式之一。我們的前期研究顯示，SFRP家族基因啟動子甲基化在早期CRC組織中具有高頻甲基化。

本研究通過檢測CRC和大腸良性病變患者糞便標本中SFRP1和WIF-1基因啟動子的甲基化狀況，探討二者作為CRC篩選標志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年3月～2013年3月武漢大學中南醫院住院患者145例，其中CRC 48例，男24例、女24例，年齡19～86歲、平均61.1歲;大腸腺瘤35例，男23例、女12例，年齡25～74歲、平均56.3歲;大腸增生性息肉32例，男17例、女15例，年齡31～79歲、平均54.4歲。均經術后病理或內鏡活檢病理證實。入選標準:無家族CRC及大腸息肉病史;收集糞便前5 d內未進行結腸鏡檢查、灌腸等侵入性操作;CRC患者未行術前放化療。另選擇30例性別、年齡匹配的健康人作為對照組，全結腸鏡檢查均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集 收集受試者術前或腸鏡檢查前自然排出的新鮮糞便樣本，－80℃保存待測。

1.2.2 DNA提取 稱取 200 mg糞便，使用QIAamp糞便DNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)提取DNA。引物序列由上海生工生物工程公司合成。上游引物:5'-TGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGT-3'，下游引物:5'-AGCCAATGGGACCTGCTCCTCCCTTGA-3'，擴增產物長度 133 bp。25 μL PCR反應體系:上下游引物各 1 μmol/L、模板 2 μL、PCR Mix 12 μL、雙蒸水 9 μL。PCR 反應條件:94 ℃ 3 min，94℃、62℃、72℃各30 s，35個循環;72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產物行3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并保存結果。

1.2.3 甲基化特異性PCR DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化回收主要根據文獻［1］方法，并加以改進。修飾后DNA分別用各基因的甲基化、非甲基化引物擴增。引物序列由上海生工生物工程公司合成。SFRP1甲基化引物:上游引物:5'-TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3'，下 游 引 物:5'-CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG-3'，擴增產物長度126 bp;SFRP1非甲基化引物:上游引物:5'-GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT-3'，下游引物:5'-CTCAACCTACAATCAAAAACAACACAAACA-3'，擴增產物長度135 bp。WIF-1甲基化引物:上游引物:5'-GGGCGTTTTATTGGGCGTAT-3'，下游引物:5'-AAACCAACAATCAACGAAC-3'，擴增產物長度197 bp;WIF-1非甲基化引物:上游引物:5'-GGGTGTTTTATTGGGTGTAT-3'，下游引物:5'-AAACCAACAATCAACAAAAC-3'，擴增產物長度198 bp。PCR反應體系 25 μL:模板 DNA 2 μL、5 μmol/L 上下游引物各 1 μL、Mg2+1.5 mmol/L、10 mmol/L、dNTPs 2 μL、Taq酶1 U。PCR反應條件:95℃ 5 min，95℃、各基因的退火溫度、72℃各45 s，38個循環;72℃延伸8 min。反應產物于3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測產物，凝膠成像系統照相并分析。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據的比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組糞便中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化狀態 見表1。SFRP1和WIF-1聯合檢測CRC和大腸腺瘤的敏感性分別為77.1%和65.7%，特異性為93.3%。SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在CRC組和腺瘤組間無統計學差異(P＞0.05)，而在CRC組和增生性息肉組、CRC組和對照組、腺瘤組和增生性息肉組、腺瘤組和對照組比較均有統計學差異(P均 ＜0.05)。增生性息肉組和對照組SFRP1基因甲基化有統計學差異(P＜0.05)，WIF-1基因甲基化無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組SFRP1和WIF-1基因甲基化陽性率［例(%)］

2.2 聯合檢測SFRP1和WIF-1基因甲基化對大腸腺瘤的診斷 腺瘤組糞便中SFRP1和WIF-1基因甲基化陽性率分別為57.1%和42.9%，進展期腺瘤明顯高于非進展期腺瘤。SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在進展期腺瘤和增生性息肉間有統計學差異(P＜0.01);而非進展期腺瘤和增生性息肉間無統計學差異(P＞0.05)。聯合兩種基因對CRC和進展期腺瘤的檢測率分別為77.1%和80.0%。

2.3 CRC糞便中SFRP1和WIF-1基因甲基化狀態與臨床病理特征的關系 CRC糞便DNA中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤部位、Duke分期、淋巴轉移及遠處轉移均無相關性(P均＞0.05)。見表2。

表2 糞便SFRP1和WIF1基因甲基化與CRC臨床病理特征的關系

3 討論

CRC的發生、發展是一個多因素、多階段、多步驟漸進演化的過程，涉及遺傳性改變和表觀遺傳的異常［2］。腫瘤抑制基因的表觀沉默是腫瘤發生的一個重要機制。正常情況下，大腸上皮細胞會持續釋放到腸腔內，并隨糞便排出體外，整個腸黏膜4 d內更新1次［3］。大腸惡性瘤細胞脫落速度是正常細胞的4～5倍［4］，由于腫瘤細胞更新速度快，黏附力差，很容易在糞便中檢測到與CRC相關的分子標志物。因此糞便異常基因甲基化在大腸腫瘤早期篩查診斷中具有重要的臨床價值。

Wnt途徑在細胞的增殖和分化等生理過程中起重要作用，同時參與腫瘤形成的異常調控途徑。Wnt途徑異常激活促進瘤細胞增殖，抑制凋亡［5］，與多種人類腫瘤相關，如頭頸部腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、白血病等，大腸腫瘤尤其常見［6～10］。SFRP 家族、WIF-1是Wnt途徑Ⅰ類胞外拮抗物，能通過不同的機制直接與Wnt反應，或與Frizzled受體形成無作用的復合體，抑制 Wnt途徑［11］。正常情況下，Wnt拮抗基因的表達能有效地抑制Wnt途徑的激活。

本研究顯示，增生性息肉、腺瘤和CRC患者，糞便SFRP1基因啟動子甲基化的陽性率分別為21.9%、57.1%和 68.8%，而 WIF-1 基因甲基化的陽性率分別為18.8%、42.9%和60.4%。SFRP1和WIF-1基因甲基化在增生性息肉、腺瘤和CRC的發生頻率逐漸增高，提示它們可能是正常大腸黏膜發生惡性轉化的基礎。我們前期的研究也顯示，SFRP家族、WIF-1基因在大腸腫瘤早期存在高頻率甲基化［9］。

據統計，僅6%的腺瘤會轉變為腺癌。本研究顯示，糞便中SFRP1和WIF-1基因甲基化對于進展期腺瘤的檢測率明顯高于非進展期腺瘤，進展期腺瘤中聯合SFRP1和WIF-1基因的甲基化頻率為80.0%，明顯高于非進展期腺瘤的55.0%，說明進展期腺瘤組織有惡變趨勢。表明SFRP1和WIF-1基因甲基化是CRC的一個頻繁的早期事件，且在CRC演變過程中通過腺瘤致癌的轉化而增加，二者聯合對進展期腺瘤的檢測率達73.3%。經典的腺瘤—腺癌途徑大概需要5～10年的時間，因此在CRC的早期篩查中有充分的時間可以檢測并去除這些高危病變，對可疑病例行結腸鏡檢查并治療，從而降低CRC的發生率。

本研究中，對照組SFRP1和WIF-1基因異常甲基化各出現1例，此結果可能是由于SFRP1和WIF-1異常甲基化頻繁出現在癌前隱窩病灶，且病變較小，而內鏡下未能發現。因此，糞便中 SFRP1和WIF-1基因異常甲基化的患者屬于CRC的危險人群，需要長期跟蹤隨訪。本研究尚未發現糞便中基因甲基化狀態的改變與大腸腫瘤的臨床病理特征有相關性，表明這些標記物在近端、遠端大腸腫瘤的檢測中具有同等的檢測效率。近年來，右半結腸腫瘤的發生率逐年增加［12］，糞便SFRP1和WIF-1甲基化在早期篩查右半結腸癌方面具有重要作用。

綜上所述，糞便SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化有可能成為大腸腫瘤早期診斷的生物學標志，有望成為CRC早期無創診斷或高風險人群篩選的一種新型途徑。

［1］Herman JG，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93(18):9821-9826.

［2］D＇Alessio AC，Szyf M.Epigenetic tete-a-tete:the bilateral relationship between chromatin modifications and DNA methylation［J］.Biochem Cell Biol，2006，84(4):463-476.

［3］Itzkowitz S，Brand R，Jandorf L，et al.A simplified，noninvasive stool DNA test for colorectal cancer detection［J］.Am J Gastroenterol，2008，103(11):2862-2870.

［4］Davies RJ，Miller R，Coleman N.Colorectal cancer screening:prospects for molecular stool analysis［J］.Nat Rev Cancer，2005，5(3):199-209.

［5］Fodde R，Smits R，Clevers H.APC，signal transduction and genetic instability in colorectal cancer［J］.Nat Rev Cancer，2001，1(1):55-67.

［6］Fendri A，Khabir A，Hadri-Guiga B，et al.Epigenetic alteration of the Wnt inhibitory factor-1 promoter is common and occurs in advanced stage of Tunisian nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer Invest，2010，28(9):896-903.

［7］Wissmann C，Wild PJ，Kaiser S，et al.WIF1，a component of the Wnt pathway，is down-regulated in prostate，breast，lung，and bladder cancer［J］.J Pathol，2003，201(2):204-212.

［8］Voorham QJ，Janssen J，Tijssen M，et al.Promoter methylation of Wnt-antagonists in polypoid and nonpolypoid colorectal adenomas［J］.BMC Cancer，2013，13:603.

［9］Qi J，Zhu YQ，Luo J，et al.Hypermethylation and expression regulation of secreted frizzled-related protein genes in colorectal tumor［J］.World J Gastroenterol，2006，12(44):7113-7117.

［10］裴磊，葉麗平.Wnt抑制因子SFRP基因甲基化與白血病的關系［J］.山東醫藥，2011，51(33):109-111.

［11］Kawano Y，Kypta R.Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway［J］.J Cell Sci，2003，116(Pt 13):2627-2634.

［12］Ahlquist DA，Zou H，Domanico M，et al.Next-generation stool DNA test accurately detects colorectal cancer and large adenomas［J］.Gastroenterology，2012，142(2):248-256，e25-e26.