利用細胞工程技術改造重組蛋白生產用CHO細胞的研究進展

劉娜，袁寶珠

重組蛋白產品，即通過 DNA 重組技術使目的基因在相應宿主細胞中表達所獲得的蛋白產品。其中，E.coli 源的占 42%，酵母源的占 21%，中國倉鼠卵巢（Chinese hamster overy，CHO）細胞源的占 29%。而在與治療和預防相關的重組蛋白中，CHO 細胞源的已近 70%[1]。

CHO 細胞是在 1957年由美國科羅拉多大學Theodore T.Puck 從一成年雌性倉鼠卵巢中分離獲得的，其增殖快，在體外傳代上百次后仍保持增殖能力[2]。該細胞染色體數為 22 條，性狀和帶型特征獨特，因此早期多被用于遺傳學研究。

在表達重組蛋白方面，與 E.coli、酵母菌相比，CHO 細胞具有相對完善的蛋白質翻譯后修飾系統。此外，由于生物技術發展和高產篩選方法的逐步優化，CHO 細胞已成為目前表達重組蛋白最為理想的細胞基質[3]。然而，現階段 CHO細胞的重組蛋白產品的產量及活性尚無法完全滿足市場需求，傳統的改良手段已很難再提高 CHO 表達重組蛋白的能力。而細胞工程技術，特別是基因沉默（RNAi）技術，具有提高重組蛋白產量和（或）活性的巨大潛力。然而，在我國尚未見到利用此策略改造 CHO 細胞的報道。本文就CHO 細胞改造，尤其是基于 RNAi 技術的改造作簡要綜述，為我國建立自主知識產權的細胞系奠定基礎。

1 CHO 細胞生物學特性

1.1 適于重組蛋白表達的生物特性

CHO 細胞很少分泌內源性蛋白，但可高表達成熟的外源蛋白。綜合起來，CHO 細胞適于重組蛋白表達的主要生物學特征如下[4]：

⑴翻譯后修飾功能：該功能使蛋白在分子結構、理化特性和生物功能方面接近于天然蛋白。CHO 可確保所表達的外源蛋白正確折疊，并具有很高的生物學活性。如CHO 細胞表達的人 sApo2L-Fc 融合蛋白，生物活性可高達 105IU/mg[5]。

⑵適應懸浮培養的能力：CHO 細胞易于從貼壁生長狀態轉變為懸浮生長狀態（馴化-adaptation）。經懸浮培養后，每天的平均比生長速率由最初的 0.27 提高到 0.48，而目的蛋白的活性則可提高 300% 以上[6]。

⑶外源重組基因高效擴增和表達的能力：目前已有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因缺失的 CHO 變異體[7]。這兩種變異體分別經甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）或蛋氨酸亞氨基代砜（methionine sulfoximine，MSX）強化篩選后，可增加重組蛋白的基因拷貝數，從而提高表達水平[8]。例如，當 MTX 濃度為 1.0 μmol/L 時，重組 IgG-E3.3的表達量提高 1 倍，并且生物活性也隨之增強[9]。

⑷產物胞外分泌功能：如在 CHO 細胞中選擇合適的信號肽后，重組蛋白（以熒光素酶為例）的產量可提高1.5 倍[10]。該特性大大簡化了生產工藝下游的蛋白分離和純化過程[1]。

1.2 CHO 細胞生產的重組蛋白產品

1987年，血纖維蛋白溶酶原激活劑（activase，r-tPA）在 CHO 細胞中首次成功表達，并獲得美國 FDA 批準用于臨床，標志著以 CHO 細胞為基礎的生物制藥時代的到來[11]。

目前國內批準上市的治療產品有重組人促紅細胞生成素（EPO）、重組人 II 型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白、重組人表皮生長因子衍生物等產品。在預防類產品中，主要是重組乙型肝炎疫苗。而 EBV 疫苗、艾滋病疫苗等的研發，也都在 CHO 細胞中取得了一定的進展。

2 CHO 細胞改造策略

為提高 CHO 細胞生產重組蛋白的產量和（或）活性，人們已對 CHO 細胞培養條件、表達載體系統及對 CHO細胞本身進行了多方面、多水平的改造。主要的改造策略可以分為傳統改造策略和細胞工程改造策略。

2.1 傳統策略

傳統的策略主要包括：①改良培養基成分：如使用丁酸鈉，該方法可明顯提高 CHO 細胞合成重組蛋白的產量[12]，但丁酸鈉濃度高時卻可加速細胞的凋亡；②建立無血清培養（SFM）方法[13]：該策略雖降低產物純化成本和減少血制品帶來的潛在危害性，但 SFM 往往導致細胞活力差，貼壁性差，外源蛋白分泌能力差等缺點；③載體優化：構建含有強啟動子的重組載體[14]，如在表達載體中加入泛染色體開放元件（universal chromatin opening elements，UCOE）序列[15]，或是內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）序列[16]，以提高目的基因轉錄效率。但上述策略并非從改進宿主細胞自身生物學特性著手，因此改良效率有限。

2.2 細胞工程策略

近年來，人們開始通過細胞工程技術對 CHO 細胞進行改造。細胞工程技術，主要指應用不同的分子生物學手段，改變不同類型細胞生物學功能的基因結構或表達水平，特別是通過基因敲除、基因過表達或基因沉默等影響與特定生物學功能相關基因的表達水平的技術，以獲得特定生物學功能發生改變的細胞[17]。而在 CHO 細胞的應用研究中，主要利用改變與重組蛋白表達量或活性相關生物學功能基因表達水平的策略，提高目的重組蛋白的產量或活性。

基因敲除，為經同源重組或鋅指核酸酶等介導，從基因組中敲除特定基因序列的技術策略[18]。例如，通過構造具有特異性的鋅指核酸酶，特定敲除谷氨酰胺合成酶基因，建立 GS 缺失細胞系[7]。由于該技術相對較為復雜，所以在CHO 細胞改造過程中，人們更多地選擇靈活性更強的基因過表達和基因沉默策略。

基因過表達技術，即是通過基因轉染結合強啟動子的使用，使特定基因高水平持續表達以獲得相應細胞生物學特性的技術。例如，可以通過基因轉染 CHO 細胞，提高 Hsp70、Hsp40 的表達，促進重組蛋白抗體的折疊和分泌，實現重組蛋白生產的優化[19]。另外，通過抗凋亡蛋白的過表達，提高細胞對凋亡的抗性而延長生存時間，也可以實現重組蛋白產量的提高。如將外源 Bcl-2 抗凋亡基因轉入 CHO 細胞，實現該蛋白過表達，提高抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的相對比值，可有效抑制細胞凋亡，進而提高目的重組蛋白（如hTPO）的產量[20-21]。

基因沉默，即通過降低基因轉錄水平和轉錄產物的穩定性等方法，以關閉部分或全部基因的表達，從而獲得具有目的性狀的細胞。該策略一般經 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術來實現。RNAi 技術作用機制類似于內源途徑產生的 microRNA，可特異降解靶基因 mRNA。通過導入與靶基因 mRNA 特定區域互補的小分子 siRNA，經互補配對可在細胞內形成 RISC（RNA induced silencing complex），進一步引起靶 mRNA 的降解或者阻止翻譯的進行[8]。盡管CHO 細胞內源 miRNA 表達譜日漸清晰[22]，但是內源miRNA 并非按照人們意愿發揮作用，因此，利用 RNAi 技術靶向調節不同基因表達很有必要。目前，RNAi 可以簡單地分為以下兩類：將外源合成的 siRNA 通過質脂體等轉染細胞，實現瞬時干擾靶基因的表達（此方法多用于驗證RNAi 策略的有效性）；或是經載體（如質粒 DNA 載體或病毒載體）攜帶表達 siRNA 特定 DNA 片段（shRNA）轉染或感染細胞，在細胞內產生 siRNA，長期穩定地抑制靶基因的表達，此方法可用于建立新的穩定細胞系[8]。

利用基因沉默從不同的細胞生物學角度改造 CHO 細胞的主要策略包括以下 5 種：①減弱或破壞細胞凋亡機制；②影響細胞糖基化修飾功能[23]；③降低二氫葉酸還原酶活性[7]；④干擾乳酸脫氫酶 A 亞基表達[24]；⑤穩定細胞骨架蛋白[25]等。而此處詳細介紹減弱細胞凋亡機制的策略。

生產用細胞經長時間大規模培養后，有害代謝物的累積以及必要營養成分的降低都可能誘導細胞凋亡，這也極可能是影響重組蛋白產量提高的瓶頸之一。細胞內除凋亡酶（如啟動凋亡酶 caspase-8、9、10，效應凋亡酶 caspase-3、7）外，還存在多種促進凋亡的蛋白分子，如 Bax、Bak、Bad、Bim 等凋亡蛋白。凋亡誘導信號，經內外源通路及級聯反應（cascade）的方式逐級放大，最終導致細胞死亡[26]。

利用 RNAi 技術抑制凋亡過程的發生，可選擇不同的凋亡酶作為靶分子。例如通過 RNAi 技術抑制 caspase-3、caspase-7 的表達，可以有效降低丁酸鈉對 CHO 細胞的誘導凋亡作用，更為重要的是當兩種凋亡酶表達經同時導入兩個 RNAi 而發生同時降低時，目的蛋白 hTPO 的表達產量顯著提高（55%）[27]；但是當單純抑制 caspase-3 的表達，目的蛋白的表達量只提高了 16%[28]。

除凋亡酶外，也可選擇其他促凋亡蛋白作為 RNAi 技術的候選靶分子。有報道發現，通過選擇 Bak和 Bax 作為RNAi 靶蛋白的策略來改造 CHO 細胞，Bak 和 Bax 的表達同時降低，細胞對凋亡的抵抗能力增強 1.6 倍，同時目的蛋白（IFN-γ）的產量提高了 35%[29]。另外的例子是通過RNAi 技術干擾 Agl-2、Requiem 這兩個凋亡早期基因，并配合其他抗凋亡蛋白的過表達，可使 CHO 細胞合成目的蛋白（IFN-γ）量提高 2.5 倍[30]。因此，由于細胞內存在多個促進凋亡的蛋白，所以可根據情況選擇不同的蛋白作為RNAi 的靶分子，增強 CHO 細胞的抗凋亡能力，最終提高目的蛋白的產量。

除抑制凋亡機制外，其他通過 RNAi 技術提高重組蛋白表達量或活性的策略包括：①降低 α-1，6 巖藻糖基轉移酶基因（Fut8）的表達（改造后的細胞 Fut8 基因的表達水平只有原來的 20%），進而降低目的重組抗體的巖藻糖糖基化程度，其結果為提高抗體 Fc 段與其受體的親和力，減少血漿成分中對目的重組抗體相關 ADCC 活性的限制，最終可提高目的抗體 ADCC 的活性百倍以上[23]；②建立新的DHFR 低表達的細胞系：利用 RNAi 技術降低 DHFR 表達所建立的新 CHO 細胞系較傳統基因敲除方法效率更高，因此能建立新的更有效的 DHFR 缺陷的 CHO 細胞株[8]；③限制乳酸脫氫酶（LDH）A 亞基基因的表達，抑制糖酵解中丙酮酸向乳酸的轉化，提高 CHO 細胞對培養過程中乳酸積累所致凋亡的抵抗性，進而提高目的重組蛋白（如TPO）的產量[24]；④通過降低 Cofilin 的表達維持細胞骨架蛋白的穩定性，可從多方面（如促進基因轉錄、減少凋亡等）增加細胞活性，進而改善細胞合成外源重組蛋白的功能（如堿性磷酸酶 SEAP 的表達量可提高 60% 以上[25]）。

3 小結

長期以來，為提高目的重組蛋白的產量和活性，人們已經對 CHO 細胞進行了多方面的改造。在多種改造策略中，以 RNAi 技術為基礎的基因沉默策略，由于其操作簡便、穩定、靈活及效率高等優點，較傳統改造策略更具有技術上的優勢，并能從細胞工程的角度對細胞進行改造，因此必將是目前及未來改造 CHO 細胞和不斷提升其重組蛋白生產能力的主要技術策略。

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