G蛋白偶聯受體對T型鈣通道調節機制的研究進展

黃 沙，黃東陽，張海林

（河北醫科大學藥理學教研室，河北石家莊 050017）

T型鈣通道又稱低電壓激活鈣通道（LVA鈣通道）是一種電壓依賴型鈣離子通道，其組織分布廣泛，在調控神經放電、激素分泌、平滑肌收縮等生理過程中具有重要的作用［1］。1975年Hagiwara等［2］使用雙電極電壓鉗的方法證實不同鈣通道的存在，然而區分出多種鈣通道是在1984～1985年，利用單通道膜片鉗技術，人們直接地記錄到了T型鈣電流［3］，此類通道的單通道電導非常低，約為5～9 pS（110 mmol·L－1Ba2＋），因此又被稱為小電導型電流。T型鈣通道由于激活電壓較低（＞－70 mV），失活速度較快，開放時間較短等特征，并對心臟的起搏、中樞及外周神經元的興奮性等有重要影響，故一直是電生理研究領域的熱點。T型鈣通道家族目前有3個成員，即 Cav3.1（α1G）、Cav3.2（α1H）、Cav3.3（α1I）［4］。近年來，越來越多的證據表明，T型鈣通道在機體生理和病理情況中都起著非常重要的作用，如睡眠、疼痛、癲癇、高血壓、充血性心衰、癌癥、帕金森病等［5－6］。T型鈣通道在細胞中的分子調節機制尚不很明確，因此，闡明T型鈣通道調節機制有重要意義。大量研究表明，G蛋白偶聯受體（GPCRs）以及下游多種第二信使都對T型鈣通道起到一定調節作用［4，7－8］。本文將重點針對近年來有關 GPCRs對 T型鈣通道調節作用的研究進展進行綜述。

GPCRs是一類具有7次跨膜結構的細胞表面受體，其細胞膜內側部分與鳥苷酸結合蛋白（G蛋白）相偶聯。當GPCRs被相應配體激活后，首先激活偶聯的G蛋白，G蛋白作為一種轉導體可以將細胞外的信號轉化為細胞內信號，從而引起細胞內各種調節作用。G蛋白由α、β、γ3個亞基組成。根據 Gα亞基的不同，G蛋白被分為4個亞類（Gαs、Gαi／o、Gαq／11、Gα12／13）。目前已知哺乳類具有 20多種不同的Gα亞基，至少5種不同的 Gβ亞基和12種不同的Gγ亞基［9］。

近年來的研究發現，GPCRs對T型鈣通道調節機制主要分為兩大途徑：一種是單獨由G蛋白βγ亞基介導的調節；另一種是由激活GPCRs后，繼而激活Gα亞基以及下游第二信使介導的調節。為方便比較，本文將對第2種途徑按不同受體進行分類闡述。

1 G蛋白βγ亞基對T型鈣通道的調節

為了研究G蛋白βγ亞基是否參與調節T型鈣通道，2003年 Barrett實驗室 Wolfe等［10］將 β2γ2和 β1γ2分別與α1H共表達于HEK293細胞中，發現β2γ2能夠選擇性抑制Cav3.2（α1H）電流。進一步研究表明 β2γ2的作用是由于β2γ2與 Cav3.2（α1H）通道蛋白Ⅱ －Ⅲ跨膜區胞內連接片段結合所導致。此區域被替換后，抑制作用就會消失；將此片段轉接到 Cav3.1（α1G）通道結構中，發現 β2γ2也可以抑制Cav3.1（α1G）鈣電流。因此，Ⅱ －Ⅲ連接片段是 β2γ2抑制Cav3.2電流的關鍵位點。

此研究結果與 Herlite等［11］發現的 G蛋白 βγ對 Cav2（N、P／Q型）高電壓激活鈣通道的抑制機制較為相似。但不同的是β2γ2對T型鈣通道的抑制作用是非電壓依賴型，而βγ對Cav2抑制是電壓依賴型［10］。傳統觀點認為，G蛋白βγ亞基通過結合并改變通道的開放模式從而起到對Cav2的抑制作用，由于βγ與通道的結合具有電壓依賴性，所以這種抑制作用也具有電壓依賴性，并且此結論被大量實驗所證實［11］。這就是人們很早提出的“willing-reluctant”門控模型［12］。針對這一不同，Wolfe等［10］也作出了相應解釋，雖然β2γ2對Cav3.2通道的抑制作用是非電壓依賴，但其并沒有改變通道蛋白的細胞膜表面表達。

隨后，同樣是Barrett實驗室，Hu等［13］的進一步研究發現，蛋白激酶A（PKA）能夠調控G蛋白β2γx亞基對Cav3.2電流的非電壓依賴性抑制作用，而且此抑制作用是通過1 107位的絲氨酸磷酸化實現的，而1 107位絲氨酸殘基是通道孔蛋白Ⅱ－Ⅲ連接片段的關鍵位點。

2 多種G蛋白偶聯受體對T型鈣通道的調節

研究表明，在背根神經節（DRG）、心肌等原代細胞中，激活GPCRs（如NK1受體、阿片受體、多巴胺受體等）都對T型鈣電流有調節作用，并且此過程涉及細胞內多種第二信使［4，7］。然而，由于這些細胞中T型鈣通道亞型不同、G蛋白不同、GPCRs不同，加之實驗條件不同，使得這些研究結果之間存在許多矛盾之處。然而近年來，將編碼單一T型鈣通道亞型和單一GPCR的cDNA共表達于異源細胞系（如HEK293細胞等），成為研究T型鈣通道調節機制一種很好的方法［14］。因此，本文將把原代細胞和表達系統的研究結果結合起來討論，以便更好地理解GPCRs對T型鈣通道復雜的調節機制。

2.1 NK 1受體 NK1受體屬于GPCRs的一員，可被速激肽P物質和神經激肽A（NKA）激活。NK1受體主要與Gq／11家族偶聯，能激活典型的 PLCβ、PIP2、DAG、PKC信號通路［15］。

早期研究發現，在大鼠脊髓側角神經元中，P物質可以增大鎳敏感的T型鈣電流。然而，在大鼠基底核神經元上，鎳敏感的T型鈣電流被P物質抑制。除此之外，在蟾蜍胃平滑肌細胞上，P物質可以增大L型鈣電流，但是對T型鈣電流無作用。

2010年，Rangel等［15］將 Cav3.2和 NK1受體共表于HEK293細胞中，研究發現NK1受體激動劑NKA可抑制Cav3.2電流。應用Gq／11抑制劑RGS2和RGS3T，可阻斷此抑制作用；分別使用PLCβ和PKC的選擇性抑制劑U73122、bisindolylmaleimide I，亦可以阻斷此抑制作用。由此得出，通過Gq／11偶聯的 NK1受體，經PKC信號通路能夠抑制重組Cav3.2通道電流。

2.2 毒蕈堿受體 毒蕈堿受體簡稱M型受體，可分為5種亞型（M1～M5）。

早期研究發現，在大鼠CA1海馬中間神經元以及過表達M3和M5受體的3T3成纖維細胞（NIH3T3）中，M受體激動劑乙酰膽堿可以增加T型鈣電流；在大鼠DRG細胞中，乙酰膽堿卻抑制T型鈣電流；在大鼠膽堿能基底前腦神經元大細胞中，乙酰膽堿對T型鈣電流無作用。

2007年，Hildebrand等［16］將 M1受體與 Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3分別共表于HEK293H細胞中，利用打孔膜片鉗記錄方式，發現激活M1受體能夠很大程度地選擇性抑制Cav3.3電流，而對 Cav3.1、Cav3.2沒有作用或產生小幅度的增大作用。研究還發現M1受體對Cav3.3電流的抑制作用是通過Gq／11，且激活Gq／11偶聯的M3和M5受體也能夠抑制Cav3.3電流，但激活Gi偶聯的M2和M4受體無此作用。2011年，Zhang等［17］在小鼠DRG小神經元中發現，激活M3受體能夠抑制T型鈣電流。在內液中加入GDP-β-S或預孵育PTX，能夠完全阻斷此抑制作用。當使用去極化前刺激時，此抑制作用仍然存在，表明激活M3受體所引起的T型鈣電流的抑制并不是因為G蛋白βγ亞基與T通道的直接結合。進一步實驗結果表明，使用白屈菜赤堿和新型PKC阻斷劑GF109203X能夠阻斷此抑制作用。然而，應用經典的PKC阻斷劑Ro31-8820或抑制PKA，并不能阻斷此抑制作用。因此，作者總結得出：M3受體介導的T型鈣電流的抑制是通過PTX敏感的新型PKC途徑。

2.3 促腎上腺皮質素釋放因子受體 促腎上腺皮質素釋放因子（CRF）是機體重要的神經調節因子，其信號的傳導也是通過G蛋白偶聯受體，包括CRFR1和CRFR2。

2007年Kim等［18］的研究發現，在MN9D多巴胺能細胞中，激活CRFR能夠抑制T型鈣電流。應用CRFR1特異性阻斷劑，此抑制作用消失。并且，這種抑制作用可被PKC激動劑所模擬，以及被PKC抑制劑所阻斷。這些結果表明，在MN9D細胞中，CRFR1對T型鈣電流的抑制作用是通過激活PKC信號途徑介導的。然而，2008年Tao等［19］在表達系統HEK293細胞中的研究結果卻與之不同，他們將CRFR1與Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3分別共表于 HEK293細胞中，激活CRFR1能夠選擇性抑制Cav3.2電流，而對 Cav3.1和Cav3.3電流無作用。并且此抑制作用并不依賴PLC、酪氨酸激酶、PKC以及其他激酶途徑，而是依賴于霍亂毒素敏感的G蛋白的βγ亞基。這些結果表明，CRFR1對T型鈣通道的調節高度依賴細胞內環境。

2.4 阿片受體 體內至少存在8種阿片受體亞型，而中樞神經系統內至少存在4種亞型（μ、κ、δ和σ）。現廣泛認為，此 4種阿片受體都與 Gαi／o偶聯［20］。

1991年在大鼠DRG神經元上，Schroeder等［21］發現選擇性μ受體激動劑DAMGO可以抑制T型鈣電流。然而，2004年Wu等［22］研究發現，在大鼠小直徑DRG神經元中，DAMGO對T型鈣電流（＞100 pA）無作用，但可以抑制高電壓激活的鈣電流（HVA鈣電流）。對于這種矛盾現象，Wu等［23］的進一步研究結果對此作了合理的解釋。他們研究了T型鈣通道蛋白和μ型阿片受體兩者在大鼠DRG中表達的關系。RT-PCR結果表明，μ受體mRNA僅存在于缺乏明顯T型鈣電流的DRG神經元中，即有明顯T型鈣電流的DRG神經元不表達μ受體。

2.5 多巴胺受體 多巴胺受體根據生化和藥理學性質，可分為D1類和D2類受體。其中，D1類受體包括D1、D5，與Gαs偶聯；D2類受體包括 D2、D3、D4，與 Gαi／o偶聯［24］。

早期，人們就分別在小雞感覺神經元、腎上腺腎小球區細胞等原代細胞中發現多巴胺可以抑制鎳敏感的T型鈣電流。1997年Drolet等［25］在腎上腺腎小球區細胞上，發現D1受體介導的T型鈣電流的抑制是需要Gβγ和cAMP的聯合作用。此結果現已被Hu等［13］的研究進一步證實，一方面，蛋白激酶A（PKA）能夠調控 β2γx亞基對 Cav3.2電流非電壓依賴型抑制；另一方面，D1和D2受體在調控Cav3.2通道過程中存在協作作用。將Cav3.2表達到H295R細胞中（該細胞本身表達有內源性多巴胺受體，但不表達Cav3.2通道），根據抑制后電流特性的相似變化，證實多巴胺確實在H295R細胞中模擬了HEK293細胞中β2γ2對Cav3.2電流的非電壓依賴型抑制。為了進一步探索多巴胺受體介導Cav3.2電流的抑制是否需要cAMP和活性Gβγ，分別加入了Gβγ消除蛋白transducin、βARKct或PKA選擇性抑制劑PKI，結果發現多巴胺對Cav3.2電流的抑制作用被消除了。接著，又嘗試單獨使用D1或D2受體選擇性激動劑，發現并不能抑制Cav3.2電流，而當聯合應用時就能夠抑制Cav3.2電流。所以，Hu等［13］提出，多巴胺調控 Cav3.2電流是雙重受體調節機制，即：多巴胺引起的Cav3.2電流非電壓依賴性抑制作用需要活性Gβγ和PKA共同介導。

除上述幾種G蛋白偶聯受體以外，還有GABAB受體和神經介素受體等其他GPCRs對T型鈣通道的調節。但龐大的GPCRs的數量也增加了研究的難度 。因此，雖然人們針對GPCRs對T型鈣通道的研究并不少，但其調節機制的復雜，至今仍然并不清晰。

3 結語

T型鈣通道在生理和病理情況下都有著重要作用，大量神經遞質和激素都通過G蛋白偶聯受體而對其起到調節作用，因此闡明G蛋白偶聯受體對T型鈣通道的調節機制顯得越發重要。回顧以往的研究，我們能夠發現，GPCRs對T型鈣通道的調節并不是上述兩種途徑的單獨作用，而是由兩種途徑共同作用，即：我們不能簡單地認為其僅僅是通過βγ亞基的抑制，而沒有第二信使的參與，反之亦然。因此，實際情況似乎看起來并不像原來預期的那樣簡單。然而，隨著各個偶聯受體和通道亞型在表達系統的建立以及有關T型鈣通道其他方面的研究進展，如基因敲除動物的產生、特異性阻斷劑的研發等，相信此科學問題將會獲得更好的解答。

參考文獻：

［1］ Perez-Reyes E.Molecular physiology of low-voltage-activated ttype calcium channels［J］.Physiol Rev，2003，83（1）：117－61.

［2］ Hagiwara S，Ozawa S，Sand O.Voltage clamp analysis of two inward currentmechanisms in the egg cell membrane of a starfish［J］.JGen Physiol，1975，65（5）：617－44.

［3］ Carbone E，Lux H D.A low voltage-activated，fully inactivating Ca channel in vertebrate sensory neurones［J］.Nature，1984，310（5977）：501－2.

［4］ Huc S，Monteil A，Bidaud I，et al.Regulation of T-type calcium channels：Signalling pathways and functional implications［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1793（6）：947－52.

［5］ Nilius B，Carbone E.Amazing T-type calcium channels：updating functional properties in health and disease［J］.Pflugers Arch，2014，466（4）：623－6.

［6］ 黃東陽，劉雅妮，張海林.T型鈣通道生理病理學功能及其分子調節機制［J］.中國藥理學通報，2013，29（2）：166－9.

［6］ Huang D Y，Liu Y N，Zhang H L.Physiological and pathophysiological significance of T-type calcium channels and themolecular modulation mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：166－9.

［7］ Iftinca M C，ZamponiGW.Regulation of neuronal T-type calcium channels［J］.Trends Pharmacol Sci，2009，30（1）：32－40.

［8］ Perez-Reyes E.G protein-mediated inhibition of Cav3.2 T-type channels revisited［J］.Mol Pharmacol，2009，77（2）：136－8.

［9］ Wettschureck N，Offermanns S.Mammalian G proteins and their cell type specific functions［J］.Physiol Rev，2005，85（4）：1159－204.

［10］Wolfe JT，Wang H，Howard J，etal.T-type calcium channel regulation by specific G-protein betagamma subunits［J］.Nature，2003，424（6945）：209－13.

［11］Herlitze S，Garcia D E，Mackie K，et al.Modulation of Ca2＋channels by G-protein beta gamma subunits［J］.Nature，1996，380（6571）：258－62.

［12］Hille B.Modulation of ion-channel function by G-protein-coupled receptors［J］.Trends Neurosci，1994，17（12）：531－6.

［13］Hu C，DePuy SD，Yao J，etal.Protein kinase A activity controls the regulation of T-type Cav3.2 channels by G dimers［J］.JBiolog Chem，2009，284（12）：7465－73.

［14］Chemin J，Traboulsie A，Lory P.Molecular pathways underlying the modulation of T-type calcium channels by neurotransmitters and hormones［J］.Cell Calcium，2006，40（2）：121－34.

［15］Rangel A，Sanchez-Armass S，Meza U.Protein kinase C-mediated inhibition of recombinant T-type Cav3.2 channels by neurokinin 1 receptors［J］.Mol Pharmacol，2010，77（2）：202－10.

［16］Hildebrand M E，David L S，Hamid J，et al.Selective inhibition of Cav3.3 T-type calcium channels by Gq／11-coupled muscarinic acetylcholine receptors［J］.JBiol Chem，2007，282（29）：21043－55.

［17］Zhang Y，Zhang L，Wang F，et al.Activation of M3 muscarinic receptors inhibits T-type Ca2＋channel currents via pertussis toxin-sensitive novel protein kinase C pathway in small dorsal root ganglion neurons［J］.Cell Signall，2011，23（6）：1057－67.

［18］Kim Y，Park M K，Uhm D Y，et al.Modulation of T-type Ca2＋channels by corticotropin-releasing factor through protein kinase C pathway in MN9D dopaminergic cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，358（3）：796－801.

［19］Tao J，Hildebrand M E，Liao P，etal.Activation of corticotropinreleasing factor receptor 1 selectively inhibits Cav3.2 T-Type calcium channels［J］.Mol Pharmacol，2008，73（6）：1596－609.

［20］Al-Hasani R，Bruchas M R.Molecular mechanisms of opioid receptor-dependent signaling and behavior［J］.Anesthesiology，2011，115（6）：1363－81.

［21］Schroeder JE，Fischbach P S，Zheng D，et al.Activation ofmu opioid receptors inhibits transient high-and low-threshold Ca2＋currents，but spares a sustained current［J］.Neuron，1991，6（1）：13－20.

［22］Wu Z Z，Chen SR，Pan H L.Differential sensitivity of N-and P／Q-Type Ca2＋channel currents to a opioid in isolectin B-positive and-negative dorsal root ganglion neurons［J］.J Pharmacol Exp Therap，2004，311（3）：939－47.

［23］Wu Z Z，Cai Y Q，Pan H L.A functional link between T-type calcium channels andμ-opioid receptor expression in adult primary sensory neurons［J］.JNeurochem，2009，109（3）：867－78.

［24］Missale C，Nash SR，Robinson SW，et al.Dopamine receptors：from structure to function［J］.Physiol Rev，1998，78（1）：189－225.

［25］Drolet P，Bilodeau L，Chorvatova A，etal.Inhibition of the T-type Ca2＋currentby the dopamine D1 receptor in ratadrenal glomerulosa cells：requirement of the combined action of the G betagamma protein subunit and cyclic adenosine 3′，5′-monophosphate［J］.Mol Endocrinol，1997，11（4）：503－14.