鷹嘴豆芽素A對雌激素缺乏誘發大鼠骨質疏松癥的作用

周延萌，寧慧嫻，張小敏，高允生，武繼彪

（1.山東中醫藥大學基礎醫學院，山東濟南 250355；2.泰山醫學院藥學院，山東 泰安 271016）

骨質疏松（osteoporosis，OP）是以骨量減少，骨組織微細結構破壞，骨脆性增加為特征的一種系統性、全身性骨骼疾病，是最常見的老年性骨代謝疾病，女性因絕經后雌激素明顯缺乏而易發生。鷹嘴豆芽素A（biochanin A）來源于豆科植物鷹嘴豆種子的胚芽部分，紅車軸草全草等，已證實具有雌激素樣作用。本研究通過去卵巢手術，建立大鼠絕經后骨質疏松動物模型，研究鷹嘴豆芽素A對去卵巢骨質疏松大鼠的作用，并觀察其對大鼠乳腺組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用60只6月齡♀ Wistar大鼠，體質量（300±30）g，山東魯抗醫藥股份有限公司，動物合格證號：SCXK（魯）2005－0017。

1.2 藥物及試劑 鷹嘴豆芽素A（陜西慈緣生物技術有限公司，含量為99.67%）；β-雌二醇（Sigma公司）；雌二醇放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所。

1.3 實驗儀器 DPX-L型雙能X線骨密度儀（美國Lunar公司）；SN695型放射免疫計數器（上海日環儀器廠）；RM2145型石蠟切片機（德國LEICA公司）。

1.4 藥物配制 取鷹嘴豆芽素A，用無水乙醇、吐溫80、蒸餾水以1∶1∶8充分攪拌溶解［1］，按 10 ml·kg－1體積配成不同劑量組（7，20，60 mg·kg－1）；β-雌二醇也用無水乙醇、吐溫80、蒸餾水以1∶1∶8配制，給藥劑量為 0.35 mg·kg－1。

1.5 模型制備及給藥 大鼠10%水合氯醛（0.3 ml／100 g）麻醉后，無菌條件下切除雙側卵巢，假手術組只切除卵巢附近一塊脂肪組織。術后d 8，對去卵巢大鼠進行連續5 d的陰道涂片檢查，所有大鼠未處于動情周期，用于試驗。術后第4周開始灌胃給藥，假手術組及去卵巢模型組大鼠給予等容量溶劑，連續12周。

1.6 指標及方法

1.6.1 股骨骨密度測定 取左后肢股骨，剝離干凈后以紗布包裹標號，放于生理鹽水中，置于－20℃冰箱中待測骨密度。采用DPX-L型雙能X線骨密度檢測儀測試大鼠股骨骨密度。

1.6.2 雌激素水平測定 末次給藥6 h后，大鼠股動脈取血，進行雌激素水平測定。血清雌二醇含量用放射免疫法測定。

1.6.3 脛骨、乳腺組織形態學觀察 取大鼠同側脛骨和乳腺，迅速浸入10%的福爾馬林固定，脛骨用硝酸法脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察脛骨和乳腺組織形態變化。

1.7 統計學處理 各項參數均表示為ˉx±s，采用SPSS 12.0統計軟件進行分析，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 鷹嘴豆芽素A對OVX大鼠體重的影響 在造模的4個月時間里，模型組大鼠體重增長較快，在給予鷹嘴豆芽素A3個月過程中，大鼠體重的增長有所控制，與假手術組相近。雌激素組與模型組比較體重明顯下降（P＜0.05），見Tab 1。

2.2 鷹嘴豆芽素A對OVX大鼠股骨骨密度的影響 結果表明，模型組大鼠股骨骨密度與假手術組比較明顯降低（P＜0.05）。鷹嘴豆芽素A和雌二醇能明顯增加骨質疏松大鼠股骨的骨密度，其中高、中劑量組效果明顯（P＜0.01），見 Tab 2。

2.3 鷹嘴豆芽素A對OVX大鼠體內雌激素水平的影響結果表明，與假手術組比較模型組大鼠血清E2水平降低（P＜0.05）。應用鷹嘴豆芽素A治療后，大鼠體內E2水平不同程度升高，特別是高、中劑量組大鼠體內E2升高明顯（P＜0.05），見 Tab 3。

2.4 大鼠脛骨組織形態學觀察 顯微鏡下，假手術組大鼠脛骨骨松質結構清楚，骨小梁粗細均勻，相互連接成網狀，骨髓充滿骨髓腔。去卵巢大鼠骨小梁稀疏、細小，骨髓腔內含有大量脂肪細胞。鷹嘴豆芽素A各劑量組和雌激素組與模型組比較，骨組織形態均有不同程度的改善：骨小梁增多，較為粗大，且有些骨小梁相互連接，骨髓腔內脂肪細胞減少。

2.5 大鼠乳腺組織形態學觀察 假手術組腺泡較少，腺管稍擴張，去卵巢組未見腺泡，脂肪組織及結締組織與其他組比較稍少，乳腺呈萎縮狀態，鷹嘴豆芽素A低劑量組及中劑量組與模型組差異無顯著性，高劑量組腺泡明顯增多甚至多于雌激素組，腺管囊性擴張。

Tab 1 Effects of biochanin A on rat weight（±s，n＝8）

Tab 1 Effects of biochanin A on rat weight（±s，n＝8）

*P＜0.05 vs model

Group Dose／mg·kg－1 Weight／g 30 days 60 days 90 days 120 days Sham － 354.20±32.91 390.36±37.61 403.92±40.67 429.92±48.05 Model － 352.33±13.60 390.60±13.13 432.18±11.96 461.27±15.87 E2 0.35 362.17±23.35 373.57±21.62 387.80±23.97 386.39±35.43*Bio A 7 361.50±24.82 375.61±13.97 408.40±26.38 432.00±23.59 Bio A 20 351.76±39.18 367.17±31.77 410.00±29.40 425.57±30.09 Bio A 60 364.67±29.04 375.57±33.40 402.91±37.92 413.83±45.21

Tab 2 Effects of biochanin A on BMD of rat femur（±s，n＝8）

Tab 2 Effects of biochanin A on BMD of rat femur（±s，n＝8）

＃P＜0.05 vs sham；**P＜0.01 vs model

Group Dose／mg·kg－1 Femur BMD／g·cm－2 Sham － 0.173±0.004 Model － 0.164±0.002＃E2 0.35 0.170±0.004 Bio A 7 0.171±0.004 Bio A 20 0.177±0.003**Bio A 60 0.183±0.002**

Tab 3 Effects of biochanin A on rat E2ˉ±s，n＝8）

Tab 3 Effects of biochanin A on rat E2ˉ±s，n＝8）

＃P＜0.05 vs sham；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model

Group Dose／mg·kg－1 E2／ng·L－1 Sham － 2.076±0.712 Model － 1.185±0.132＃E2 0.35 2.323±0.875**Bio A 7 1.427±0.493 Bio A 20 1.977±0.332*Bio A 60 2.099±0.644*

3 討論

原發性骨質疏松主要是雌激素缺乏。當♀大鼠的卵巢被切除后，由于雌激素缺乏，導致骨代謝不平衡，成骨細胞活動減弱，造成骨形成不足，活化破骨細胞，骨吸收亢進，松質骨出現明顯的骨丟失，骨強度下降，這些松質骨的骨丟失是伴隨骨轉換增強而進行的，這種特性和人正常絕經后高轉換型骨質疏松的骨丟失狀態有許多相似之處［2］。大鼠卵巢切除模型已被公認為金標準模型。去卵巢大鼠由于體內雌激素水平下降，引起脂代謝紊亂，導致肥胖。大鼠體重明顯增加，可部分抑制去卵巢大鼠的骨丟失，肥胖婦女絕經后骨質疏松和骨折發病率較低可能與此有關［3］。

雖然植物雌激素被認為是一種天然的雌激素受體調節劑，與雌激素有很大不同。多數資料顯示，植物雌激素對乳腺的作用還沒有定論。本實驗中，大鼠去勢后乳腺組織明顯萎縮，未見明顯腺泡結構，給予鷹嘴豆芽素A低、中劑量治療后，乳腺組織仍呈萎縮狀態，未見明顯腺泡結構，說明一定劑量范圍內的鷹嘴豆芽素A對乳腺組織沒有刺激增生和癌變的作用。但是高劑量的鷹嘴豆芽素A對乳腺組織的雌激素作用增強，腺泡明顯增多，腺管囊性擴張。這與一些學者的高劑量異黃酮可誘導乳腺增生和癌變發生的論點吻合［4－5］，但其量效關系及機制還需進一步研究。

參考文獻：

［1］ 周延萌，宋立群，馬曉茜，等.紅車軸草異黃酮對維甲酸致小鼠骨質疏松的預防作用［J］.中國藥理學通報，2010，26（12）：1658－61.

［1］ Zhou Y M，Song LQ，Ma X Q，et al.Preventive effectof trifolium pratense isoflavones on retinoic acid induced osteoporosis in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（12）：1658－61.

［2］ 劉忠厚主編.骨質疏松學［M］.北京：人民衛生出版社，1998：511.

［2］ Liu Z H.Osteoporosis［M］.Beijing，People’smedical publishing house，1998：511.

［3］ Wronski T J，Schenck P A，Cintron X X，et al.Effect of body weight on osteopenia in ovariectomized rats［J］.Calcif Tissue Int，1987，40（3）：155－9.

［4］ Messina M，McCaskill-StevensW，Lampe JW.Addressing the soy and breast cancer relationship：review，commentary，and workshop proceedings［J］.JNatl Cancer Inst，2006，98（18）：1275－84.

［5］ Messina M.Conclusion that isoflavones exert estrogenic effects on breast tissue and may raise breast cancer risk unfounded［J］.Mol Nutr Food Res，2008，52（2）：299－300.