ERO1α及其DNA甲基化在同型半胱氨酸抑制肝細胞增殖中的作用

趙 麗，曹成建，劉現(xiàn)梅，孔繁琪，馬文斌，周龍霞，陳久凱，張鳴號，焦 運，楊曉玲，姜怡鄧

（寧夏醫(yī)科大學1.檢驗學院、2.基礎(chǔ)學院、3.總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，研究表明其可能通過甲硫氨酸循環(huán)影響基因的甲基化水平參與疾病的發(fā)生［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α（endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-α，ERO1α）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種氧化酶，對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用［2］，主要負責維持肝細胞生長、支持細胞生存等［3］，研究表明，Hcy可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERs）抑制肝細胞增殖［4］，但 Hcy是否通過影響ERO1αDNA甲基化及其表達進而抑制肝細胞增殖目前未見報道。因此，本研究擬從DNA甲基化修飾角度探討ERO1α在Hcy抑制肝細胞增殖中的作用，為防治高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocy steinemia，HHcy）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 超凈工作臺（蘇州安泰，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；實時熒光定量PCR儀（上海風嶺，中國）；普通PCR儀（Bio-Rad，美國）；Epoch全波段酶標儀（BioTek，美國）；電泳儀（Bio-Rad，美國）；凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；青、鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所）胰酶（Solarbio）；同型半胱氨酸（Hcy，Sigma）；DNA提取試劑盒（TIANGEN）；RNA提取試劑盒（TIANGEN）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermantas）；熒光定量試劑盒（Fermantas）；anti-ERO1α（Abcom）；HRP標記二抗（北京中杉）；全蛋白提取試劑盒，MTT試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；lipo2000（Invitrogen）；DNA甲基化修飾試劑盒（ZYMO）；引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理 HL7220肝細胞株購自長沙市湘雅研究所細胞庫。用含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。用含100μmol·L－1Hcy的培養(yǎng)液刺激細胞，并設(shè)置正常對照組（0μmol·L－1Hcy），每組重復3次，孵育48 h后收集細胞，凍存于－80℃，待用。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測ERO1αmRNA的表達在Pubmed數(shù)據(jù)庫中查詢ERO1α獲取其編碼序列，采用Premier5.0設(shè)計相關(guān)引物。提取各組細胞的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為：42℃60 min，70℃5 min。以cDNA為模板進行熒光定量PCR。ERO1α熒光引物（上游 5′-ATCCTTTGGCTTCTGGTCAAG-3′；下游 5′-GTTGTGTCCCCATTTCTTTTCT-3′），PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃15 s，58℃ 30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。

1.2.3 Western blot檢測 ERO1α蛋白的表達 采用全蛋白提取試劑盒提取兩組細胞全蛋白，取20μl進行SDS-PAGE凝膠電泳，120 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%的脫脂奶粉封閉2 h，與anti-ERO1α4℃孵育過夜，HRP標記二抗孵育2 h，于凝膠成像分析儀上成像分析，以 β-actin為內(nèi)參，計算 ERO1α與 β-actin內(nèi)參灰度值的比值，進行分析。

1.2.4 ERO1α重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 提取肝細胞基因組DNA，擴增ERO1αDNA片段。上游引物：5′-CCGCTCGAGATGGGCCGCGGCTGGGGATTCTTGT-3′，下游引物：5′-AATTCTGCAGATGAATATTCTGTAACAAGTTCCTGAAGTTTTC-3′。設(shè)計 XhoI和 Pst I為酶切位點。將提純的ERO1αDNA片段與EGFPN1質(zhì)粒分別用XhoI和Pst I進行雙酶切。用T4連接酶將ERO1αDNA片段定向克隆到EGFP-N1質(zhì)粒的XhoI和Pst I酶切位點。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為EGFP-N1-ERO1α。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。挑取在含有氨芐青霉素的LB平板生長的單菌落，小量培養(yǎng)后，用特異性ERO1α引物對菌液進行PCR篩選，電泳驗證產(chǎn)物長度。同時將培養(yǎng)菌株送上海生工公司進行測序。肝細胞密度達80%時，用lipo2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝細胞，以無血清培養(yǎng)基孵育6h。除去培養(yǎng)基，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基孵育48 h。

1.2.5 MTT檢測肝細胞增殖活力 將肝細胞吹打成單細胞懸液，在96孔板中加入細胞懸液100μl／孔（約1×104），37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)液，分別加入普通培養(yǎng)液及含100μmol·L－1Hcy的培養(yǎng)液，每組8孔，孵育48 h后，除去培養(yǎng)液，每孔加50μl 1×MTT，37℃孵育4 h，除去上清，每孔加150μl DMSO，搖勻后用酶標儀測定550 nm波長處各孔的吸光度。

1.2.6 巢式降落式甲基化特異性 PCR（ntMSPCR）檢測ERO1α啟動子區(qū)DNA甲基化按DNA提取試劑盒說明書提取各組細胞全基因組DNA，亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA進行甲基化修飾。nt-MSP法檢測ERO1α啟動子區(qū)DNA甲基化程度的改變。針對 ERO1α啟動子區(qū)，在線（http：／／www.urogene.org／cgi-bin／methprimer／methprimer.cgi）設(shè)計一對外引物及兩對內(nèi)引物（外引物：上游5′-CCAATCCTAATCTTTTAA CATTCAAA-3′，下 游 5′-TAGTTTGGGTAATATGGTGAAATTT-3′；甲基化引物：上游5′-ACTAACCTACAATAATAC GATCGCA-3′，下游 5′-AGTTTGGGTAATATGG TGAAA TTTC-3′；非甲基化引物：上游 5′-ACTAACCTA CAATAAT ACAATCACA-3′，下游5′-AGTTTGGGTAATATGGTGAAATTTC-3′）。外引物擴增的反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，20個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5℃至49℃，72℃7min。以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，進行內(nèi)外引物的擴增。反應(yīng)條件同外引物。取5μl PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度，按如下公式進行計算：甲基化／%＝甲基化OD值／（甲基化OD值＋非甲基化OD值）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果以ˉx±s表示。兩樣本間比較采用t檢驗，多樣本間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Hcy抑制肝細胞增殖 100μmol·L－1Hcy刺激肝細胞48 h后，以MTT法檢測正常對照組及Hcy干預組肝細胞增殖活力的改變，結(jié)果顯示：與正常對照組相比，Hcy組肝細胞增殖活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見 Fig 1。

Fig 1 Hcy inhibits proliferative activity of hepatocytesCellswere treated with 100μmol·L－1 Hcy for48h.**P＜0.01 vs NC group

2.2 Hcy抑制 ERO1α的表達 100μmol·L－1Hcy刺激肝細胞48 h后，分別以熒光定量PCR及Western blot檢測正常對照組及Hcy干預組ERO1α mRNA及蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，Hcy干預后，ERO1αmRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01），見 Fig 2。

Fig 2 Hcy inhibits expression of ERO1αA：Change of ERO1αmRNA expression of the NC and Hcy groups；B：Change of ERO1αprotein expression of the NC and Hcy groups.Cells were treated with 100μmol·L－1 Hcy for48 h.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group

2.3 ERO1α參與Hcy抑制肝細胞增殖 測序結(jié)果證明ERO1α重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見Fig 3A。轉(zhuǎn)染肝細胞后，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表達明顯，見 Fig 3B。qRT-PCR及 Western blot驗證ERO1αmRMA及蛋白表達增加，見Fig 3C，D。MTT法檢測ERO1α過表達后肝細胞增殖活力的改變，與對照組相比，ERO1α重組組肝細胞增殖活力明顯升高，差異有顯著性（P＜0.01），見 Fig 3E。

2.4 Hcy導致 ERO1αDNA甲基化改變 100 μmol·L－1Hcy刺激肝細胞后，分析ERO1αDNA甲基化水平的改變。結(jié)果顯示：與正常對照組相比，ERO1αDNA甲基化程度增加，差異有顯著性（P＜0.05），見 Fig 4。

3 討論

肝損傷病人依賴于肝臟的再生恢復正常代謝，而肝細胞增殖是肝臟再生的基礎(chǔ)。HHcy被認為是肝纖維化、非酒精性脂肪肝等的獨立危險因子［5－6］。研究表明Hcy可擾亂肝細胞正常的細胞周期進而抑制其增殖［4］。本研究結(jié)果顯示Hcy刺激后肝細胞增殖活力減弱，與文獻報道一致。

ERs是Hcy誘導細胞發(fā)生功能障礙的機制之一，ERO1α又名內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原樣蛋白（endoplasmic reticulum oxidoreduclin-like protein1α），是一種黃素蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其編碼基因位于人類第14號染色體上，研究表明，其主要作用為參與新生肽鏈正確折疊成有生物活性的蛋白質(zhì)［2］、維持細胞增殖等，其表達異常可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。ERO1α依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起Ca2＋釋放，進而觸發(fā)細胞凋亡途徑。而ERO1α是否參與了Hcy導致的肝細胞增殖抑制未見報道。本研究結(jié)果表明：Hcy在抑制肝細胞增殖的同時，也導致了ERO1αmRNA及蛋白表達水平的明顯下降。多次重復試驗均得到一致的結(jié)果，提示ERO1α可能參與了Hcy抑制肝細胞增殖的過程。為了進一步驗證此結(jié)果，構(gòu)建了ERO1α重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝細胞使其過表達，發(fā)現(xiàn)ERO1α過表達后Hcy對肝細胞增殖的抑制作用明顯降低，表明ERO1α在Hcy抑制肝細胞增殖過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

Hcy是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，參與了甲硫氨酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。Hcy濃度異常可導致甲硫氨酸循環(huán)紊亂，使甲基供體生成量改變引起多個基因甲基化狀態(tài)的改變。DNA甲基化是指CpG位點的胞嘧啶被甲基修飾，從而在基因結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)較早的表觀遺傳學修飾方式之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性、DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況的改變［8－9］，從而控制基因表達。前期研究也發(fā)現(xiàn) Hcy可使多種基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，進而影響其表達。一般來講，DNA甲基化改變包括低甲基化和高甲基化，低甲基化可促進基因的表達，而高甲基化則抑制基因表達［10］。ERO1α啟動子區(qū)富含CpG位點，因此設(shè)想，DNA甲基化這一表觀遺傳學機制可能參與了Hcy調(diào)控ERO1α的表達進而抑制肝細胞增殖，因此我們進一步檢測了Hcy干預后ERO1α啟動子區(qū)甲基化程度的改變。研究結(jié)果表明：Hcy提高了ERO1α啟動子區(qū)DNA甲基化程度，而DNA高甲基化是基因轉(zhuǎn)錄抑制的重要標志，與ERO1α mRNA及蛋白表達水平降低相一致。

綜上所述，Hcy可能增加 ERO1α啟動子區(qū)DNA甲基化程度，使ERO1α表達水平降低，進而導致肝細胞增殖抑制。此發(fā)現(xiàn)可能是Hcy導致肝功能障礙的重要機制，為進一步了解Hcy與肝臟疾病的關(guān)系提供了新的實驗依據(jù)。

Fig 3 ERO1αinvolved in Hcy-induced proliferation inhibition of hepatocytesA：Result of sequencing of ERO1αrecombinant plasmid；B：Fluorescence images of hepatocyteswith recombinant plasmids；C：Change of ERO1α mRNA expression after transfected with recombinant plasmids；D：Change of ERO1αprotein expression after transfected with recombinant plasmids；E：Change of proliferative activity after transfected with recombinant plasmids.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group

Fig 4 Hcy causes the change of ERO1αDNA methylation levelM：Methylated production；U：Unmethylated production.Cells were treated with 100μmol·L－1 Hcy for 48 h.*P＜0.05 vs NC group.

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