淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對阿爾采末病轉(zhuǎn)基因動物模型的學習記憶能力及病理學影響

董賢慧，高維娟，孔衛(wèi)娜，張 瑜，邵鐵梅，于文國，柴錫慶，

（1.河北醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院，河北石家莊 050000；3.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050200；4.承德醫(yī)學院，河北 承德 067000）

阿爾采末病（Alzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的以進行性記憶和認知功能障礙為特征的神經(jīng)變性疾病。特征性病理變化表現(xiàn)為膽堿能神經(jīng)元功能障礙、神經(jīng)元和突觸丟失、細胞外β-淀粉樣肽（amyloid beta，Aβ）聚集形成老年斑（sennepfaques，SPs）［1］和細胞內(nèi)高度磷酸化的 tau蛋白形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。

中藥淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分具有調(diào)節(jié)臟腑功能，對AD有一定的治療作用。本實驗以APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基小鼠為動物模型，采用 Morris水迷宮、改良Bielschowsky銀染法以及尼氏染色法探討淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對 APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力及病理學影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組處理 ♂的APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠6月齡20只，隨機分為模型組（Tg組）和復(fù)方組（Tg effective fraction組），每組10只小鼠。復(fù)方組小鼠給予中藥淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分復(fù)方灌胃，1次／天，連續(xù)灌胃3個月。中藥淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分分別為淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素，3種有效成分按照比例3∶2∶2，即淫羊藿苷120 mg·kg－1、黃芪甲苷 80 mg·kg－1、葛根素80 mg·kg－1體重給予小鼠灌胃。模型組采用等量生理鹽水灌胃。6月齡C57BL／6J小鼠10只作為陰性對照（Non-Tg）。全部動物分別單籠喂養(yǎng)于光照／黑暗為12 h／12 h的恒溫環(huán)境，自由攝食和飲水。

1.2 采用M orris水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力 采用Morris水迷宮對各組小鼠進行行為認知能力測試。Morris水迷宮主要由圓形水池和自動錄像及分析系統(tǒng)組成。圓形水池直徑120 cm、高50 cm，平臺直徑為10 cm，在整個實驗中保持操作者位置及周圍環(huán)境的相對穩(wěn)定。

1.2.1 定位航行試驗 歷時5 d，每日分上、下午兩個時段，固定時間為每日上午 9：00－11：00，下午14：00－16：00進行。每個時段分別從4個不同的入水點入水，將大鼠面向池壁放人水中，記錄2 min內(nèi)尋找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期。若小鼠入水后2 min內(nèi)未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留10 s，記錄逃避潛伏期為120 s。每次訓練時間間隔為60 s。同時記錄各組小鼠的游泳速度，計算其平均游泳速度。

1.2.2 空間探索實驗 用于測量動物對平臺空間位置準確記憶，即記憶保持能力。d 6撤除平臺，任選一個入水點將動物放入水中，動物在水中游泳120 s，測量120 s內(nèi)小鼠跨過原平臺的次數(shù)，即為跨臺次數(shù)。

1.3 改良Bielschowsky銀染法觀察小鼠腦內(nèi)老年斑 小鼠水迷宮后，甲醛灌注處死后取腦，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片脫臘至水，20%AgNO3水溶液37℃孵育30 min，4%甲醛還原，滴加氨銀染液200 μl室溫孵育10 min，3%甲醛溶液浸泡，逐級酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.4 尼氏染色觀察 取石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后入蒸餾水，置于預(yù)熱至60℃的2%硫瑾染色30 min后，以蒸餾水速洗，用95%酒精分色，鏡檢至神經(jīng)元尼氏體清晰呈紫色，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。Morris水迷宮逃避潛伏期采用重復(fù)測量資料的方差分析（RM ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 M orris水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力情況 水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠的逃避潛伏期與C57對照組小鼠相比明顯延長（P＜0.05），復(fù)方組小鼠的逃避潛伏期與模型組小鼠相比明顯縮短（P＜0.05），如 Fig 1。

Fig 1 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the escape latency of them ice in each group**P＜0.01 vs C57 group；＃＃P＜0.01 vs AD model group.

APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的游泳速度與 C57對照組小鼠相比增大（P＜0.05），復(fù)方組小鼠的游泳速度與模型組小鼠相比無差異（P＞0.05），如Fig 2。

Fig 2 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the average swimming velocity of themice in each group**P＜0.01 vs C57 group.

空間探索實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠與C57對照組小鼠相比跨臺次數(shù)減少（P＜0.05），復(fù)方組小鼠跨臺次數(shù)與模型組小鼠相比明顯增多（P＜0.05），如 Fig 3。

2.2 改良Bielschowsky銀染法觀察小鼠腦內(nèi)老年斑 改良Bielschowsky銀染法結(jié)果顯示，C57對照組小鼠大腦皮質(zhì)未見明顯改變，神經(jīng)原纖維排列有序、稀疏，如Fig 4A。模型組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)原纖維增粗、腫脹密集成寬帶狀，深染，神經(jīng)纖維纏結(jié)明顯，分布有大量老年斑，如Fig 4B；復(fù)方組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)纖維纏結(jié)情況減輕，可見少量老年斑，如Fig 4C。

Fig 3 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the p latform crossing of them ice in each group*P＜0.05 vs C57 group；＃P＜0.05 vs AD model group.

2.3 尼氏染色觀察小鼠腦內(nèi)病理改變 尼氏染色結(jié)果顯示，C57對照組小鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊且密集，胞質(zhì)中尼氏體豐富，大腦皮層尼氏小體呈深藍色，細胞核淡藍色，背景略呈淺藍色，如圖5A；模型組小鼠神經(jīng)元水腫，細胞數(shù)量減少，排列稀疏，細胞間隙增大，胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少，分界不清，染成淡藍色，如Fig 5B；復(fù)方組小鼠較模型組小鼠神經(jīng)元水腫減輕，細胞數(shù)量增多，排量相對整齊，分界清晰，如Fig 5C。

3 討論

AD是常見的老年人慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前其病因、發(fā)病機制還不是十分清楚，很大程度上制約了AD治療藥物的篩選。

建立動物模型的目的是在實驗動物身上復(fù)制人類疾病的模型，用于研究人類疾病的病因、發(fā)病、病理變化以及疾病的預(yù)防和治療。人們已經(jīng)設(shè)計了各種動物模型諸如膽堿能系統(tǒng)損傷模型［2］、鋁模型［3］、tau蛋白模型［4］、Aβ模型［5］等，這些模型盡管可以存在部分特征性病理改變，但是因不能模擬人類疾病漸進性的退行性改變，均不太理想。

AD的病因是多元性的，遺傳因素是其中的一個重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，1號、14號、19號及21號染色體等均與AD發(fā)病密切相關(guān)［6］。其中包括APP基因、早老蛋白（presenilin，PS）基因［7］、載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）基因［8］、Tau蛋白基因［9］、UBQLN1（ubiquilin-1）蛋白基因［10］、α2巨球蛋白基因（α2M）［11］、脂蛋白受體相關(guān)蛋白基因（LRP基因）、組織蛋白酶D基因（CTSD基因）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因（ACE基因）、丁酰膽堿酯酶基因（BCHE基因）、超氧化物岐化酶基因、α1-抗糜蛋白酶基因、突觸核蛋白基因及二氫脂酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因以及其他許多不直接生成蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)元素，此外，目前日趨成熟的轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）技術(shù)可以在活體上研究某一特定致病基因的作用，這些為轉(zhuǎn)基因動物模型的建立提供了可能。

Fig 4 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the senile plaques in cerebral cortex of them ice in each groupA：Non-Tg；B：Tg；C：Tg effective fraction

Fig 5 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the cellular morphology in cerebral cortex of them ice in each groupA：Non-Tg；B：Tg；C：Tg effective fraction

阿爾采末病轉(zhuǎn)基因動物模型種類繁多，包括單轉(zhuǎn)基因動物模型，像 PDAPP小鼠［12］、Tg2576［13］、APP23［14］、PS轉(zhuǎn)基因小鼠、JNPL3［15］等；雙轉(zhuǎn)基因動物模型，像 APPswe／PS1M146L、APPSL／PS1M146L、APPSL／PS1kI、APPKM670／671NL／APPV717F［16］、APP／apoE等；還包括多重轉(zhuǎn)基因動物模型，如 APP／PS1／tau［17－18］、CDK5／p35／tau等。而目前應(yīng)用最為廣泛的為APPswe／PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該模型是野生型C57BL／6J小鼠PS1基因E9缺失，不是滅活作用，促使其功能加強，是國際公認的AD轉(zhuǎn)基因動物模型。APPswe／PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠來源于 C57BL／6J小鼠，所以本實驗選擇C57BL／6J小鼠為陰性對照組。

本實驗研究APPswe／PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型行為學及病理學變化，Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示9月齡APPswe／PS1dE9小鼠定位航行實驗與空間探索實驗結(jié)果與同月齡C57小鼠相比均有差異，說明9月齡APPswe／PS1dE9小鼠出現(xiàn)明顯的記憶能力缺陷，這與本實驗中病理學方法，改良Bielschowsky銀染法結(jié)果發(fā)現(xiàn)9月齡APPswe／PS1dE9小鼠大腦皮質(zhì)散在分布有老年斑和尼氏染色結(jié)果顯示的APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元水腫，細胞數(shù)量減少，尼氏體減少的結(jié)果相一致。

根據(jù)中醫(yī)“標本兼治”的治療原則，治療AD應(yīng)補腎健脾，益氣養(yǎng)血以培其本；化痰、祛瘀、解毒以治其標。因此，我們課題組將淫羊藿、黃芪、葛根有效組分（淫羊霍苷、黃芪總苷、葛根素）進行組方，其中淫羊藿歸肝、腎經(jīng)，具補腎填精、生精養(yǎng)髓之功效，為君藥；黃芪歸肺、脾經(jīng)，為補氣圣藥，具補氣健脾、行血化瘀之功效，為臣藥；葛根歸脾、胃經(jīng)，具清熱、降火、排毒之功效，亦可升舉清陽，引諸藥上達于頭目，為佐藥。三藥合用，共起滋補肝腎、補脾養(yǎng)血，活血化瘀、清熱解毒、健腦益智之功。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD患者在服用黃芪、淫羊藿、葛根等中藥3個月后，其智力和記憶力得到有效提升，日常生活自理能力也有所增強，且治療中未出現(xiàn)明顯不良事件和副反應(yīng)［19］。

本課題針對AD虛、痰、瘀、毒共存互結(jié)的發(fā)病特點，制定補虛、化瘀、滌痰、解毒的治法，將淫羊藿、黃芪、葛根組方，發(fā)現(xiàn)淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以有效地改善APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學習記憶能力，減輕其大腦皮質(zhì)神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑以及神經(jīng)元水腫等改變。

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