白藜蘆醇通過減緩內質網應激及增加 eNOS的表達改善高熱量高膽固醇飲食引起的內皮損傷

程靜靜，陳 莉，李朝飛，陳冠軍，鮑瑩瑩，魯云霞

（安徽醫科大學1.生物化學教研室、2.化學教研室，安徽合肥 230032；3.安徽醫科大學附屬第一醫院內分泌科，安徽合肥 230022）

內質網是細胞內膜型／分泌型蛋白質合成的細胞器，在調節蛋白質正確折疊、鈣穩態和細胞凋亡等方面具有重要作用，是維持血管內皮細胞功能的重要細胞器，葡萄糖、病毒感染、化學藥物如衣霉素等多種刺激因素誘導的內質網內未折疊／錯誤折疊蛋白質反應（unfolded protein response，UPR）和鈣穩態失衡等狀態被稱為內質網應激（ERS）［1］。過度的ERS是一系列疾病，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、神經退行性疾病和腎功能障礙等的誘因之一。

隨著肥胖人群在全球范圍內的增多，與動脈粥樣硬化相關的代謝綜合征也日益增多，血脂異常是動脈粥樣硬化的起始步驟，其早期病變是內皮細胞的損傷［2］。白藜蘆醇（resveratrol，RES）屬于一種非黃酮類多酚化合物，存在于多種植物中，具有抗自由基、抗脂質過氧化作用，對動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的防治起重要的作用［3－4］，但尚無其在血管內皮細胞中影響ERS的相關報道。已知氧化應激和ERS之間相互聯系，一方面氧化應激干擾ER中的蛋白質折疊，另一方面UPR可引起氧化應激，因此推測RES的抗氧化作用可能減少UPR和ERS［5］。本實驗旨在研究RES對高脂飲食小鼠胸主動脈血管內皮及細胞的影響是否與ERS有關。由于RES是天然無毒化合物，作用較緩慢，因此參照文獻選取單一的較高劑量 RES（400 mg·kg－1·d－1）［6］，體外實驗先用不同濃度的RES預孵育，再用一定濃度的棕櫚酸誘導，以觀察其保護作用是否具有劑量效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞株 C57BL／6小鼠24只，8周齡，清潔級，♂，體質量20～25 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，適應性飼養1周。小鼠胸主動脈內皮細胞（mouse aortic endothelial cells，MAEC），由合肥工業大學生物與食品工程學院劉健博士饋贈。

1.1.2 藥物和試劑 動物實驗用白藜蘆醇購自南京澤朗醫藥科學技術有限公司；細胞實驗用白藜蘆醇（R5010）、棕櫚酸（palmitic acid，PA）購自美國Sigma公司，四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RNAStore樣品保存液（DP408）購自天根生化科技（北京）有限公司；RT試劑盒購自Fermentus Life Sciences；DMEM培養基購自美國Invitrogen公司；鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自康為世紀生物技術有限公司；兔抗GRP78多克隆抗體購自美國 Abcam公司；鼠抗CHOP單克隆抗體購自美國CST公司；兔抗eNOS多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標記抗體和DAB均購自武漢博士德生物技術有限公司；FITC羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；增強化學發光底物檢測試劑盒（ECL發光劑）購自碧云天生物技術研究所；DAPI購自Biosharp生物科技有限公司；RIPA裂解液購自南京凱基生物科技發展有限公司。所有引物均用Primer5.0軟件設計，由上海生工生物技術工程有限公司合成（Tab 1）。

Tab 1 Primer sequences used for RT-PCR analysis of related gene expression in m ice

1.1.3 動物分組及用藥 將C57 BL／6小鼠隨機分為標準飲食組（SCD）、高熱量高膽固醇飲食組（HCD，20%豬油、20%蔗糖、10%蛋黃粉、1%膽固醇）和高熱量高膽固醇飲食＋白藜蘆醇組（HCD＋RES）。除SCD組外，其余2組均為HCD喂養，HCD＋RES組在HCD的同時灌胃白藜蘆醇（400 mg·kg－1·d－1）治療12周。所有操作均遵守安徽醫科大學實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 方法

1.2.1 胸主動脈的病理學檢測和免疫組織化學分析 小鼠處死后迅速取出胸主動脈，用4%（V／V）的多聚甲醛溶液固定72 h，石蠟包埋，4μm切片，HE染色和間苯二酚品紅染色，400倍光鏡下觀察組織的病理學改變，對比拍照。將血管以4μm連續切片，常規脫蠟至水，微波抗原修復，3%H2O2消除內源性過氧化物酶活性，PBS洗后用山羊血清封閉，eNOS羊抗兔（1∶100）4℃過夜，二抗工作液室溫孵育10 min，辣根酶標記鏈卵白素標記，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.2.2 胸主動脈的 RT-PCR分析 抽提血管總RNA，逆轉錄合成cDNA，常規PCR分析，反應條件為：預變性 94℃3 min，變性 94℃30 s、退火 55℃30 s、延伸72℃ 30 s，32個循環后 72℃延伸 5 min，3%瓊脂糖凝膠電泳，以目的條帶的灰度與內參GAPDH的灰度之比表示目的基因的表達水平。

1.2.3 MAEC細胞培養 將MAEC細胞解凍復蘇后，種植在含10%胎牛血清、105IU·L－1青霉素、105IU·L－1鏈霉素的 DMEM培養基中，37℃、5%CO2、95%濕度的條件下培養，2～3 d換液1次。待細胞生長至單層融合狀態后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.4 MTT實驗 取對數生長期細胞，接種于96孔培養板，低濃度 RES（10μmol·L－1）、中濃度 RES（50μmol·L－1）、高濃度 RES（100μmol·L－1）預處理6 h后加入0.5 mmol·L－1PA孵育，每組平行6個復孔，重復 3次，培養時間分別為 6、12、18、24 h，在達各培養時間點前4 h時，每孔加5 g·L－1MTT 20μl繼續培養4 h，去除培養基，每孔加150μl DMSO，酶標儀測定OD570。

1.2.5 Western blot 不同濃度 RES預處理后加PA共同孵育24 h，RIPA裂解液抽提細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉移到PVDF膜上，封閉后分別用抗GAPDH（1∶800）、GRP78（1∶600）的一抗4℃孵育過夜，HRP標記的二抗室溫孵育1 h，加入 ECL發光劑反應5～10 min，暗室顯影成像，實驗重復3次。

1.2.6 細胞免疫熒光 制備細胞爬片，不同濃度RES預處理后加PA共同孵育24 h，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100破膜，5%BSA封閉后加鼠抗CHOP單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜，FITC山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，DAPI染色10 min后抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 細胞免疫組化分析 制備細胞爬片，不同濃度RES預處理后加PA共同孵育24 h，4%多聚甲醛固定，其余步驟包括eNOS的濃度均同上述組織的免疫化學分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，所有實驗數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對高脂飲食小鼠胸主動脈內皮細胞病理學的影響 HE及間苯二酚染色結果顯示：SCD組小鼠動脈結構清晰，內皮細胞連續光滑完整，彈力纖維排列呈波浪狀，未見斷裂，無病理學改變；HCD組動脈管壁增厚，彈力纖維排列紊亂，局部有斷裂現象；HCD＋RES組相對于HCD組管壁變薄，彈力纖維基本無斷裂（Fig 1）。

2.2 白藜蘆醇對胸主動脈ERS中3個上游通路分子基因表達的影響 RT-PCR結果顯示：與SCD組相比，HCD組小鼠胸主動脈的ERS中3個信號通路IRE1α、ATF6以及PERK的基因水平表達均明顯升高（P＜0.05）；與 HCD組相比，HCD＋RES組PERK、IRE1α基因水平明顯降低（P＜0.05），ATF6基因的表達差異無顯著性（P＞0.05）。

2.3 白藜蘆醇對胸主動脈ERS中2個下游分子GRP78和CHOP基因表達的影響 RT-PCR結果表明：與SCD組相比，HCD組小鼠胸主動脈的ERS中GRP78和CHOP基因的表達均明顯增加（P＜0.05）；與HCD組相比，HCD＋RES組CHOP基因的表達明顯降低（P＜0.05），GRP78雖然略有升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），見 Fig 3。

2.4 白藜蘆醇對胸主動脈eNOS蛋白水平表達的影響 免疫組化結果顯示：eNOS蛋白在內皮細胞的胞質中表達；與SCD組相比，HCD組eNOS的表達降低；與HCD組相比，HCD＋RES組的eNOS表達有所增加（Fig 4）。

Fig 1 Photom icrographs ofmouse thoracic aorta w ith HE and resorcinol-fuchsin staining（×400）A.SCD group；B.HCD group；C.HCD＋RES group.1：HE staining；2：resorcinol-fuchsin staining.

Fig 2 Comparison ofmRNA expression of IRE1α，ATF6 and PERK in thoracic aorta of 3 groups*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HCD group

2.5 白藜蘆醇對棕櫚酸誘導MAEC增殖的影響由Tab 2可知：PA對MAEC增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度和時間依賴關系；RES預處理后，可改善PA對MAEC增殖的抑制作用，其中低濃度（10 μmol·L－1）RES對 MAEC改善增殖作用不明顯（P＞0.05），較高濃度作用12 h以上明顯增強（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

Tab 2 Influence of RES pretreatment on proliferation of mouse aortic endothelial cells treated w ith PA（±s，n＝3）

Tab 2 Influence of RES pretreatment on proliferation of mouse aortic endothelial cells treated w ith PA（±s，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs PA

Group 6 h 12 h 18 h 24 h NC 0.652±0.013 0.685±0.014 0.874±0.016 0.921±0.011 PA 0.543±0.021*0.565±0.016*0.665±0.015**0.636±0.014**RES10μmol·L－1 0.572±0.011 0.599±0.029 0.697±0.011 0.701±0.021＃RES50μmol·L－1 0.591±0.012＃ 0.644±0.021＃ 0.767±0.024＃ 0.782±0.012＃RES100μmol·L－1 0.607±0.025＃ 0.664±0.021＃ 0.841±0.012＃＃ 0.851±0.019＃＃

Fig 3 Com parison ofm RNA expression of CHOP and GRP78 in thoracic aorta of 3 groups*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HCD group

Fig 4 The immunohistochem ical results of eNOS in thoracic aorta of 3 groups（×400）A：SCD group；B：HCD group；C：HCD＋RES group.

2.6 白藜蘆醇對棕櫚酸誘導M AEC中GRP78蛋白表達的影響 Western blot結果表明：與NC組相比，PA組MAEC表達的GRP78蛋白水平均明顯升高（P＜0.05）；單獨使用RES組對GRP78表達沒有明顯影響（P＞0.05）；不同濃度RES干預后GRP78的蛋白水平表達相對于PA組明顯降低（P＜0.05）（Fig 5）。

Fig 5 Effect of RES pretreatment on expression of GRP78 protein induced by PA in MAEC*P＜0.05 vs NC group；＃P＜0.05 vs PA group

2.7 白藜蘆醇對棕櫚酸誘導MAEC中CHOP蛋白表達的影響 與NC組相比，PA組CHOP表達明顯增加，且定位在細胞核；與PA組相比，中、高劑量RES干預組CHOP表達明顯減少，而低濃度RES組與PA組相比，CHOP的減少不明顯（Fig 6）。

2.8 白藜蘆醇對棕櫚酸誘導MAEC中eNOS蛋白表達的影響 eNOS主要在胸主動脈內皮細胞的胞質中表達。與NC組相比，PA組eNOS表達明顯減少；與PA組相比，低濃度RES預處理后，eNOS蛋白表達無明顯增加，中、高濃度RES預處理后，eNOS蛋白表達明顯增加（Fig 7）。

Fig 6 Effect of RES pretreatment on expression of CHOP protein induced by PA in MAECs

Fig 7 Effects of RES pretreatment on expression of eNOS protein induced by PA in MAECsA：NC group；B：0.5 mmol·L－1 PA group；C：10μmol·L－1 RES＋0.5 mmol·L－1 PA group；D：50μmol·L－1 RES＋0.5 mmol·L－1 PA group；E：100μmol·L－1 RES＋0.5 mmol·L－1 PA group.

3 討論

UPR有3個主要的效應蛋白：ATF6、IRE1α和PERK，在基礎狀態下，這3個效應蛋白都與分子伴侶GRP78結合，當發生 ERS時，它們與GRP78分離，然后被激活［7］。錢磊等［2］研究發現，高脂飲食或者PA誘導時胸主動脈或內皮細胞發生ERS。本研究發現，小鼠高熱量高膽固醇飲食12周后，胸主動脈組織彈力纖維排列紊亂，ERS相關基因水平明顯升高，表明該飲食明顯激活內皮細胞的ERS通路；白藜蘆醇干預后，血管內皮中PERK、IRE1α及下游CHOP、GRP78基因的轉錄水平均明顯降低，提示白藜蘆醇保護高脂損傷大血管的作用機制可能與其緩解 ERS、降低 PERK、IRE1α及其下游 CHOP、GRP78的基因表達有關。另有研究表明白藜蘆醇可抑制缺血／再灌注和衣霉素誘導的ERS及視網膜血管變性［8］，并通過抑制GRP78蛋白的表達從而減少ERS和糖尿病大鼠的早期腎損害［9］，與本文的動物實驗研究結果基本一致。

高脂飲食后小鼠血清中16碳的軟脂酸（PA）和18碳的硬脂酸均升高，以PA升高最為明顯［10］，因此本研究先通過低、中、高劑量的白藜蘆醇預處理MAEC，然后用 PA（0.5 mmol·L－1）誘導血管內皮細胞，結果發現，中、高濃度白藜蘆醇（50、100μmol·L－1）可明顯改善PA對內皮細胞增殖的抑制作用，且呈明顯的劑量依賴關系（Tab 2）。PA可明顯增加GRP78、CHOP的蛋白表達，中、高濃度白藜蘆醇則明顯減少PA誘導的ERS。有報道稱白藜蘆醇可抑制乙醇誘導的ERS及Caspase-12，導致的肝細胞凋亡［11］，也可在HepG2細胞中通過誘導去乙酰化酶SIRT1的高表達來誘導氧調節蛋白150（ORP150）的表達以減緩PA誘導的ERS和胰島素抵抗［12］，與本文的細胞研究結果基本一致。

NO主要由eNOS催化生成后分泌到血液，參與調控血管擴張、免疫反應等多種生理和病理學過程［13］。在糖尿病早期階段，由eNOS表達改變引起的NO水平異常會導致內皮功能障礙的發生［14］，白藜蘆醇可通過上調人臍靜脈內皮細胞中eNOS的表達來發揮其血管保護作用［15］。本研究發現［16］，高脂飲食導致血管內皮細胞eNOS表達減少，細胞實驗證實PA可抑制eNOS的表達，而動物和細胞實驗的結果均表明白藜蘆醇的干預或預處理可增加eNOS的表達（Fig 4、6），提示高脂飲食和PA誘導的小鼠血管內皮細胞受損與eNOS的表達減少密切相關，而白藜蘆醇可能通過增加eNOS的表達來逆轉內皮細胞的損傷。白藜蘆醇是SIRT1的特異性激動劑，研究表明在肝細胞中，Exedin-4通過增加SIRT1的表達來減緩ERS標志基因的表達，本研究將在后續的細胞實驗中繼續觀察白藜蘆醇是否也能以類似的方式來減少ERS標志基因的表達。

綜上所述，本研究從體內和體外兩方面證實了白藜蘆醇對高熱量高膽固醇飲食和棕櫚酸誘導胸主動脈及血管內皮細胞損傷的保護作用，可能與其明顯減少ERS和增加eNOS的表達有關。然而白藜蘆醇具體如何影響ERS下游的通路，進而改變eNOS的表達、影響血管的舒張功能？以及其對ERS的影響是直接作用還是間接作用？需要進一步的實驗來證實，其機制的闡明將為開發白藜蘆醇作為以ERS及其下游PERK、IRE1α等為靶點的藥物提供理論依據。

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