PLK 1穩(wěn)定β-catenin促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

鞠吉雨，于文靜，高志芹，張維芬，杜長青，陳麗梅，連 波，趙春玲

（濰坊醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，山東濰坊 261053）

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞失去極性，經(jīng)過細(xì)胞骨架重塑轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間質(zhì)表型的過程。研究表明，EMT是促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵因素［1］。

PLK1（Polo-like kinase 1）是一種高度保守的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的絲氨酸／蘇氨酸激酶，對(duì)細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)起著重要的調(diào)控作用。近年研究發(fā)現(xiàn)PLK1高表達(dá)在許多人類腫瘤，如膀胱癌、直腸癌［2－3］。這表明PLK1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們的研究已發(fā)現(xiàn)PLK1在鱗狀食管癌組織中呈高表達(dá)［4］，慢病毒介導(dǎo)的靶向PLK1的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞體內(nèi)外的生長和侵襲轉(zhuǎn)移［5－6］。為深入研究PLK1促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了PLK1在食管鱗癌細(xì)胞TE-15中的過表達(dá)克隆和空載對(duì)照克隆，檢測(cè)PLK1過表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EMT的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 過表達(dá)PLK1的食管鱗癌細(xì)胞株TE-15和空載對(duì)照克隆由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和 FBS購自 Gibco公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購自 Invitrogen公司；PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit均購自TaKaRa公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；β-catenin siRNA寡核苷酸序列和非特異性siRNA（siRNA-NC）由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成；RIPA細(xì)胞裂解液、核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)marker均購自 Beyotime公司；Protein A／G agarose beads購自Santa Cruz公司；兔抗人vimentin／E-cadherin單抗、兔抗人 β-catenin、兔抗人 Axin／APC／GSK-3β單抗、兔抗人β-actin單抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自普利萊公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞TE-15的PLK1過表達(dá)克隆和空載對(duì)照克隆。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA干擾 β-catenin的靶序列：5′-CAGTTGTGGTTAAGCTCTTAC-3′，非 特 異 性siRNA（siRNA-NC）干擾序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。轉(zhuǎn)染前1 d，于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)種植合適數(shù)量的PLK1過表達(dá)克隆，轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為60%～70%。轉(zhuǎn)染前換成無血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合體A：將稀釋總量為50 pmol的siRNA 3μl加入47μl的無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育。B：取1μl Lipofectamine 2000加入49μl無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將復(fù)合體A和B輕輕混合，室溫孵育20 min使復(fù)合體形成。將復(fù)合體加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，孵育72 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè) TRIzol提取細(xì)胞中總RNA，取2μg使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。vimentin 上 游 引 物： 5′-CCAAACTTTTCCTCCC TGAACC-3′，下 游 引 物：5′-GTGATGCTGAGAAGTT TCGTTGA-3′，擴(kuò)增片段為141 bp；內(nèi)參 β-actin上游引 物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下 游 引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴(kuò)增片段為206 bp。結(jié)果用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot檢測(cè) PLK1過表達(dá)克隆和空載對(duì)照克隆用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次后離心，用RIPA細(xì)胞裂解液重懸，冰浴30 min，12 000 r·min－1、4℃離心20 min收集總蛋白。細(xì)胞核蛋白提取按照試劑盒說明進(jìn)行。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取80μg蛋白經(jīng)10%的 SDSPAGE電泳分離后，利用半干轉(zhuǎn)印技術(shù)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，室溫孵育2 h或4℃過夜雜交。用含5%脫脂奶粉和0.1%Tween 20的PBS洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000稀釋）孵育1 h。洗膜后用ECL法顯影。所用的一抗為：兔抗人vimentin單抗（1∶500稀釋）、E-cadherin單抗（1∶1 000稀釋）、β-catenin單抗（1∶1 000稀釋）、β-actin單抗（1∶5 000稀釋）、Histone H3（1∶1 000稀釋）。

1.2.5 免疫共沉淀 細(xì)胞總蛋白裂解液中加入約10μl Axin抗體，4°C孵育過夜。再加入20μl protein A／G瓊脂糖珠子，共同在室溫孵育4 h。3 000 r·min－1離心10 min，收集免疫共沉淀復(fù)合物，使用裂解緩沖液小心地洗免疫復(fù)合物3～5次，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。兔抗人的 Axin、APC、GSK-3β均按照1∶500稀釋。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PLK1促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞EM T的發(fā)生 用Western blot法檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞TE-15的空載對(duì)照克隆和PLK1過表達(dá)克隆中EMT標(biāo)志蛋白分子，發(fā)現(xiàn)PLK1過表達(dá)克隆中，間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin的表達(dá)明顯上調(diào)，而上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)（Fig 1A）。這表明PLK1能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞TE-15發(fā)生EMT。采用Real-time PCR檢測(cè)vimentinmRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在PLK1過表達(dá)克隆中，vimentin mRNA表達(dá)水平明顯升高（Fig 1B，P＜0.05），這提示PLK1上調(diào)vimentin表達(dá)可能是發(fā)生在對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

Fig 1 Overexpression of PLK 1 influences the expression of EMT-related protein markers（A）and upregulates the expression of vimentin mRNA（B）in ESCC cells*P＜0.05 vs vector.

2.2 PLK1上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞總蛋白和胞核中βcatenin的蛋白表達(dá)水平 由于β-catenin在對(duì)vimentin表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中起重要作用，我們繼續(xù)檢測(cè)了PLK1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-15中β-catenin蛋白表達(dá)的影響。分別提取空載對(duì)照克隆和PLK1過表達(dá)克隆的細(xì)胞總蛋白和胞核蛋白，Western blot的結(jié)果顯示，在PLK1過表達(dá)的克隆中，細(xì)胞總蛋白和胞核蛋白中β-catenin表達(dá)都明顯增加（Fig 2）。

Fig 2 Overexpression of PLK 1 increasesβ-catenin expression in ESCC cells（A）and nucleus（B）

2.3 PLK1通過提高食管鱗癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平而上調(diào)vimentin 為了確證PLK1上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中vimentin表達(dá)是否與其提高β-catenin的表達(dá)水平有關(guān)，我們采用RNA干擾技術(shù)，在PLK1過表達(dá)克隆中分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向β-catenin的siRNA和對(duì)照非特異性siRNA，Western blot的結(jié)果顯示，在PLK1過表達(dá)克隆中降低β-catenin的表達(dá)能引起vimentin的表達(dá)下降（Fig 3）。因此，PLK1確實(shí)通過提高食管鱗癌細(xì)胞TE-15中β-catenin的表達(dá)水平而上調(diào)vimentin。

Fig 3 PLK 1 upregulates the expression of vimentin by increasingβ-catenin in ESCC cells1：Vector；2：High-PLK1；3：High-PLK1＋siNC；4：High-PLK1＋si β-catenin.

2.4 PLK1能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞中β-catenin降解復(fù)合物的聚合 采用免疫沉淀和Western blot，檢測(cè)了PLK1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-15中β-catenin降解復(fù)合物的影響。結(jié)果顯示，在PLK1過表達(dá)克隆中，Axin免疫沉淀物中的APC及GSK-3β都明顯減少（Fig 4）。這提示，PLK1能夠抑制β-catenin降解復(fù)合物的聚合。

Fig 4 PLK 1 inhibits the formation of protein degradation com p lex targetedβ-catenin in ESCC cells

3 討論

EMT是癌癥發(fā)展的主要機(jī)制及轉(zhuǎn)移的起始步驟［7－8］。本研究中，通過對(duì)EMT相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)證實(shí)，PLK1能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而該過程可能是通過上調(diào)vimentin轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。

vimentin作為存在于間質(zhì)細(xì)胞中的一種中間纖維蛋白［9］，在腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、黏附和上皮癌的EMT中均起一定的作用。這提示，vimentin可作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究和治療的新靶點(diǎn)［10－12］。由于vimentin的表達(dá)往往是一些癌發(fā)生相關(guān)信號(hào)分子的下游分子，已有報(bào)道β-catenin／TCF（T cell factor，T細(xì)胞因子）復(fù)合物能激活vimentin啟動(dòng)子，上調(diào)vimentin的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能［13］。而β-catenin在Wnt／β-catenin信號(hào)通路中起核心作用［14－15］。我們的結(jié)果顯示，PLK1促進(jìn)了細(xì)胞總蛋白和核蛋白中β-catenin表達(dá)。在PLK1過表達(dá)克隆中，降低β-catenin的表達(dá)引起vimentin的表達(dá)下降。因此，PLK1確實(shí)通過提高食管鱗癌細(xì)胞中βcatenin的表達(dá)水平而上調(diào)vimentin。由于β-catenin胞質(zhì)穩(wěn)定性是其轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的前提，而調(diào)節(jié)β-catenin胞質(zhì)穩(wěn)定性的主要因素是Axin／APC／GSK-3β的多蛋白降解復(fù)合物。因此，我們又繼續(xù)檢測(cè)了PLK1對(duì)β-catenin降解復(fù)合物的影響。免疫共沉淀的結(jié)果顯示，PLK1能夠抑制β-catenin降解復(fù)合物的聚合。在PLK1過表達(dá)克隆中，βcatenin降解復(fù)合物的減少造成了β-catenin不能降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而在胞質(zhì)中累積，最終引起βcatenin轉(zhuǎn)位入核增加，導(dǎo)致vimentin基因表達(dá)上調(diào)。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)PLK1可能通過穩(wěn)定β-catenin上調(diào)vimentin的表達(dá)，而促進(jìn)了食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT。這為食管鱗癌的生物治療提供了新靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。至于PLK1如何抑制βcatenin降解復(fù)合物的聚合，詳細(xì)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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