蜘蛛毒素的生物學活性研究進展

浦飛飛，尹 松，王曉英

（1.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2.湘潭市婦幼保健院，湖南湘潭 411104）

蜘蛛在全世界達4萬余種，目前報道的蜘蛛成分主要來源于現存的編入目錄的43 244種蜘蛛中的174種［1］，我國記載的約有3 000種，劇毒蜘蛛有10多種［2］。和其它毒性物種如芋螺毒素、蝎毒、蛇毒相比，蜘蛛毒素的研究相對較少，但近年來，蜘蛛毒素成為生物毒素領域新的研究熱點之一。不同蜘蛛分泌的蜘蛛毒素不同，除毒性作用外，這些物質還具有多種活性并能對機體產生多重影響。根據蜘蛛毒素的化學成分主要分為五類，分別是無機鹽類及小的有機化合物、線性多肽、富含二硫鍵的蜘蛛毒素多肽、酶類、突觸前的神經毒素；而根據其相對分子質量大小主要分為多肽類成分、蛋白質成分、小分子物質。蜘蛛成分中作用于靶細胞膜上的各種離子通道，如鉀、鈣、鈉、酸敏感通道等，主要是多肽毒素中含量較多的神經毒素［3－4］。其小分子物質主要分為無機鹽、三磷酸腺苷、氨基酸、核苷酸、單胺類以及多胺類［5－6］。由于蜘蛛毒素成分具有多樣性和多功能性，蜘蛛毒素已經在分子藥理學、神經生物學和分子毒理學等領域有著廣泛應用，此外在新型農藥殺蟲劑等方面也有著廣泛的應用前景［7］。

1 蜘蛛毒素對細胞分泌功能的影響

蜘蛛毒素能影響細胞的分泌功能，調節細胞的分泌活性，主要是蜘蛛毒素中的某些成分能與細胞膜表面的某些受體結合。因此蜘蛛毒素在神經內分泌、疼痛的研究等具有潛在價值。

1.1 α-latrotxin毒素對細胞分泌功能的作用 我們知道如果被黑寡婦蜘蛛咬傷，會使人產生極端的疼痛，使人產生麻痹甚至會造成死亡。黑寡婦蜘蛛毒中對脊柱動物有毒的唯一成分是α-latrotxin（LTX），它能與突觸前的受體（軸突蛋白或蜘蛛素受體latrophilin）結合，進而影響細胞的分泌功能。它可以通過以下3種方式作用于細胞膜：一是在其作用的細胞膜上形成一種類似Ca2＋離子孔道，繼而激活相應的受體，鈣離子通過LTX形成的孔道大量內流從而激活鈣離子依賴性的分泌功能；二是與蜘蛛素受體latrophilin 1（一種G蛋白偶聯受體）結合，激活磷脂酶C，從而激活細胞內Ca2＋離子依賴的細胞酶聯反應，最終導致神經遞質釋放增多；三是LTX形成的四聚體插入細胞膜磷脂雙分子層，在細胞膜上形成一種類似離子和小的有機分子的孔道，在二價離子特別是鎂離子的幫助下激活鈣離子非依賴的細胞分泌功能［8］。還有研究表明，黑寡婦蜘蛛的神經毒素通過插入細胞膜的磷脂雙分子層激活相應的受體，導致神經遞質釋放增多，誘導肥大細胞發生胞吐現象［9］，另外LTX毒素能與細胞膜上的受體結合，對胰島β細胞分泌Ca2＋離子進行調節，導致磷酸肌酸降解和降解產物積累。另外來源于黑寡婦蜘蛛Latrodectus（Theridiidae）毒中的 latroinsectotoxins（LIT）α、β、γ、δ和ε有選擇性的殺蟲作用［10－11］，其殺蟲作用是通過影響突觸前神經遞質的釋放，其作用機制與LTX影響神經遞質釋放的機制類似。

1.2 PhTx3-4毒素和DkTx雙結毒素對細胞分泌功能的作用 PhTx3-4毒素來源于羅納櫛蛛屬（Phoneutria nigriventer）蜘蛛毒液，能夠同時抑制非鈣通道依賴和鈣通道依賴性的突觸體攝取谷氨酸［12］。而雙結毒素（double kont toxin，DkTx）來源于虎紋捕鳥蛛粗毒，可以特異性地激活辣椒素受體TRPV1，引起細胞內鈣的增加［13］，進而影響細胞的分泌功能。

2 蜘蛛毒素對酶活性的作用

2.1 對纖溶酶活性的影響以及抗凝作用 血栓形成是一類多因素疾病，至今已提到的危險因素約300余個。凡能使血小板黏附、聚集性增高、纖溶活性減弱、血粘度增高的因素，都成為血栓形成的因素。從敬釗纓毛蛛粗毒中分離到一種新型多肽jingzhaotin-Ⅰ，對血小板具有明顯的抑制作用，具有良好的抗凝作用［14］，因此有望開發成新型抗栓與溶栓藥物。利用纖維蛋白平板方法發現雷氏大疣蛛毒素可影響纖溶酶活性，具有良好的纖溶作用。雷氏大疣蛛是我國特有的蜘蛛，也是近幾年剛發現的新品種，這對新型溶栓藥物的開發具有重要意義［15］。

2.2 抑制蛋白酶的活性 蜘蛛毒素還具有抑制蛋白酶活性的功能。從虎紋捕鳥蛛粗毒中純化得到的HWTX-XI屬于Kunitz型毒素，是迄今為止最大的Kunitz型蜘蛛科，它由121個高質量表達序列標簽組成的38個異構體，其分子多樣性來源于 cDNA串聯重復序列。其中重組序列 HW11c4、HW11c24、HW11c27和 HW11c39都已成功表達并且純化，HW11c4和HW11c27能夠抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶等活性。這些發現從分子水平上說明了HWTX-XI分子的多樣性及絲氨酸蛋白酶抑制活性［16］。

3 蜘蛛毒素對離子通道的作用

離子通道位于膜蛋白的雙脂層，在細胞膜上形成具有高度選擇性的孔道，是神經元、肌細胞等可興奮膜上的特殊生物大分子。離子通道的現代研究中大都依賴生物毒素作為工具藥物。由于蜘蛛毒素具有極高的穩定性、特異性和效價，它們是新天然活性藥物的重要來源［17］。其中2011年FDA批準的藥物有6個來源于毒素多肽類或蛋白質，還有10個處在臨床試驗階段，以及其它更多的處在臨床前開發不同階段的毒素類藥物［18］。

3.1 蜘蛛毒素對哺乳動物Na＋通道的作用 作用于離子通道的蜘蛛毒素中有三分之一是作用于鈉離子通道的［19］。不同鈉通道亞型生理結構分布的不同決定了它們生物學活性的不同。例如：Nav1.5亞型主要分布在心臟部位，因此在心臟動作電位的上升期起重要作用；而Nav1.4亞型主要分布在肌肉組織，而其作用主要與肌肉收縮有關［20－21］；Nav1.7，Nav1.8和 Nav1.9在周邊感覺神經元選擇性表達，它們主要與脊髓疼痛的信號傳導有關［22］。因此作用于不同鈉通道亞型的毒素類化合物具有不同的潛在醫用價值。由于鈉離子通道控制著興奮細胞動作電位的產生和傳播，因此對調控神經信號起著重要作用。從Paraphysa scrofa（Phrixotrichus auratus）tarantula蜘蛛中分離的兩種鈉通道阻斷劑電壓敏感性毒素 VSTx-3（VSTx-3，ktheraphotoxin-Gr4a）和GTx1-15（Toxin Gtx1-15）能夠阻斷鈉通道，對于由神經超興奮引起的癲癇及局部麻醉過程中產生的疼痛都有潛在的醫用價值［23］。

3.2 蜘蛛毒素對昆蟲Na＋通道的作用 雖然電壓門控Na＋通道廣泛分布在生物興奮組織細胞中，是許多動植物神經毒素及藥物特異作用的靶受體，但昆蟲Na＋通道的藥理學特性與哺乳動物有明顯區別，因此蜘蛛毒素對昆蟲有選擇性的殺傷作用。而且與擬除蟲菊酯，DDT及DDT同源物等傳統農藥不存在交叉耐藥性，因此在新型安全生物殺蟲劑的研發中將發揮巨大作用［7］。

3.2.1 蜘蛛毒素對昆蟲Na＋通道作用的選擇性 截止到目前，9種哺乳動物的鈉通道亞型（Nav1.1-1.9）中除了亞型Nav1.9外，都已成功克隆表達。因此我們獲取哺乳動物鈉通道結構、功能和藥理學活性的多樣性主要是通過對多個基因的表達。相反，昆蟲類鈉通道的不同功能主要是依賴于廣泛的選擇性剪接及1個對位鈉通道基因的RNA編輯，這種RNA編輯能使昆蟲鈉通道有不同的變體。但是不同昆蟲序列中鈉通道的范圍卻是高度保守的，它們的序列同源性高達0.87～0.98。因此，作用于鈉通道的蜘蛛毒素類殺蟲劑對不同序列的昆蟲的毒性是廣泛的。而在哺乳動物中鈉通道亞型 Nav1.1-1.9中，序列的同源性水平較低，只有 0.5～0.6。總之，蜘蛛毒素殺蟲劑對昆蟲鈉通道的選擇性使昆蟲鈉通道和哺乳動物鈉通道藥理學特性有明顯區別［24］。

3.2.2 蜘蛛毒素的昆蟲鈉通道作用位點 我們知道昆蟲神經元鈉通道上有7個毒素結合位點，其中有3個是蜘蛛毒素結合位點。這3個毒素結合位點，和傳統農藥擬除蟲菊酯，DDT及DDT同源物的結合位點是不相關的，因此蜘蛛毒素和上述傳統農藥不存在交叉耐藥性。蜘蛛毒素作用于鈉通道的3個位點分別是：位點1，主要是阻斷通道口；位點3，延緩通道失活相；位點4，抑制通道激活。作用于位點1的蜘蛛毒μ-Theraphotoxin-Hhn2b（μ-TRTX-Hhn2b），其對果蠅鈉通道para／DmNa1的選擇性比對大鼠 Nav1.2的選擇性高1.5倍，而對 Nav1.1和 Nav1.4-1.8無明顯影響；作用于位點3的蜘蛛毒素 δ-Ctenitoxin-Pn1a（δ-CNTX-Pn1a）來源于蜘蛛黑腹櫛足蛛（Phoneutria nigriventer）；作用于位點4的4種殺蟲肽，δ-amaurobitoxins（δ-AMATX-Pl1a-Pl1d）來源于陰暗擬隙蛛（Pireneitega luctuosa）［25］。

3.3 蜘蛛毒素對K＋離子通道的作用 K＋通道亞型Kv4.3在調節心肌細胞動作電位的幅度與時程方面具有重要作用，是治療心律失常的有效作用靶點，但目前國內外尚缺乏該通道的特異性抑制劑。從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中純化到的一種新型肽類神經毒素 －敬釗毒素-V（Jingzhaotoxin-V，JZTXV），對大鼠背根神經節細胞上的瞬時外向K＋電流能部分抑制，其中產生瞬時外向鉀電流的鉀通道亞型主要是Kv4家族成員。研究結果顯示，5μmol·L－1JZTX-V能抑制23%的Kv4.1電流，而 585 nmol·L－1L JZTX-V能抑制 50%的Kv4.2電流［26］。研究表明，JZTX-V是 Kv4.3通道的強阻斷劑，425.1 nmol·L－1JZTX-V能抑制 50%的 Kv4.3電流［27］。因此JZTX-V除了可以開發成為研究鉀通道亞型Kv4.3的工具試劑，同時由于Kv4.3通道是治療心律不齊的靶標，所以JZTX-V也具有開發成抗心律不齊藥物的潛在醫用價值。

3.4 蜘蛛毒素對Ca2＋離子通道的作用 近年來，隨著對Ca2＋通道深入的研究，發現了很多與鈣通道結合的蜘蛛毒素，如 Phoneutria nigriventer的 Pha1β毒素及 Tx3-3［28－29］等。蜘蛛毒素的殺蟲作用，除了作用于昆蟲Na＋通道外，有研究表明蜘蛛毒素中的多肽成分也可以作用于昆蟲Ca2＋通道，來源于澳大利亞的funnel-web蜘蛛毒中的ω-Hexatoxin-Hv1a（ω-HXTX-Hv1a）原來認為對昆蟲鈣通道的作用主要是選擇性的阻斷昆蟲的Cav1亞型，但最近的研究表明ω-HXTXHv1a對蟑螂的Cav2亞型通道也有溫和的阻斷作用；來源于Plectreurys tristis蜘蛛毒中的 ω-Plectotoxin-Pt1a（ω-PLTXPt1a）能阻斷昆蟲的Cav2亞型，而對鈉、鉀通道無作用；截止到目前，還沒有發現作用于昆蟲Cav3亞型的蜘蛛毒［25］。

4 蜘蛛毒素的其它相關生物學活性

4.1 蜘蛛毒素抑制腫瘤細胞的活性 研究表明，雷氏大疣蛛毒素、敬釗纓毛蛛毒素、海南捕鳥蛛毒素、虎紋捕鳥蛛毒素對肺腺癌細胞株A549的細胞增殖具有不同的抑制作用，以雷氏大疣蛛毒素和敬釗纓毛蛛毒素對A549細胞體外增殖的抑制作用較為明顯，且呈劑量、濃度、時間依賴性關系［30］。來源于虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛蛛、海南捕鳥蛛、新疆穴居狼蛛、雷氏大疣蛛分泌的毒液均具有抑制腫瘤活性，對人肝癌BEL-7402、SMMC-7721、人胃腺癌BGC-823細胞及HepG2細胞株肺癌A549細胞［31－32］、膠質瘤細胞U251的抑制作用均有報道，但其抗腫瘤機制目前尚不十分明確，目前以誘導凋亡學說為主［33］。

4.2 蜘蛛毒素的抑菌活性 研究表明，虎紋捕鳥蛛粗毒分離得到的2種多肽毒素，huwentoxin-Ⅰ和huwentoxin-Ⅱ，能抑制革蘭陰性細菌、革蘭陽性細菌及啤酒酵母菌的生長，而且這2種多肽毒素間有一定的協同抗菌作用［34］。海南捕鳥蛛粗毒和體液通過杯碟法，發現其粗毒和體液對革蘭陰性細菌、革蘭陽性細菌有抑制作用，但對酵母菌無抑制效果，而且兩者也存在一定的協同抗菌作用［35］。

5 結語

隨著分子生物學及膜片鉗等技術的飛速發展，蜘蛛毒素的生物學活性也不斷被發現，并應用于各個領域的研究。蜘蛛毒素的神經作用機制，尤其是與離子通道相關的作用機制是蜘蛛毒素的一個研究重點，膜片鉗技術對離子通道門控動力學、生理功能、藥理學特性及結構與功能關系的研究，為一些疾病治療的新途徑提供了有效的研究方法［36］。目前發現蜘蛛毒素在新藥研究開發、生物農藥開發等各個方面顯示出廣闊的應用前景。相信通過對天然蜘蛛毒素各種成分的理化性質及功能的研究，可以更好地開發出蜘蛛毒素這一分子寶庫更大的經濟以及應用價值。

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