硫化氫促進結腸癌細胞的生長

蔡文杰，王 艷，隨 力，王銘潔

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院醫學基礎教研室，上海 200093；2.復旦大學上海醫學院生理與病理生理學系，上海 200032）

硫化氫（H2S）是一種具有廣泛生物學效應的氣體信號分子［1］，我們曾報道了 H2S具有促血管新生的能力［2－3］，而血管新生可促進腫瘤細胞的增殖和擴散。結腸癌細胞能表達合成H2S的兩個酶：胱硫醚-β-合酶 （CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶 （CSE），其中CSE含量遠大于CBS的含量［4］。本實驗通過干擾內源性H2S的生成來探討其對腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HCT116細胞購自上海中科院細胞庫，6周齡BALB／c裸鼠由復旦大學實驗動物中心提供，BrdU參入試劑盒購自Roche公司。

1.2 shRNA慢病毒的制備 針對CSE基因設計shRNA序列，克隆到 pGLVH1／GFP載體，與 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共轉293T細胞，3 d后收集培養液，超速離心后得到慢病毒。

1.3 裸鼠移植瘤實驗 分為干擾組和對照組，分別用CSE干擾慢病毒和陰性對照慢病毒感染細胞，獲得穩定表達株。干擾組細胞接種于鼠左肋部皮下，對照組細胞則接種于同一鼠的右肋部皮下，接種量都為2×106個細胞。腫瘤體積按V＝1／2長徑×短徑2計算。

1.4 細胞增殖 細胞換無血清后給予不同濃度的NaHS處理24 h，用10μmol·L－1BrdU孵育2 h，再分別用抗BrdU抗體、HRP標記的二抗處理，TMB顯色后在450 nm波長處檢測吸光度。

1.5 統計學分析 數據以ˉx±s表示，用Systat 12軟件進行統計學處理，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗。

2 結果

2.1 CSE干擾慢病毒構建成功 Real-time PCR實驗顯示，針對CSE基因895位點的shRNA序列（5′-GCCCAGTTCCTGGAATCTAATTTCAAGAGAATTAGATTCCAGGAACTGGGCTT-3′）能抑制 CSE基因的表達，抑制率達到（87.8±3.9）%。

2.2 干擾CSE表達抑制移植瘤的生長 HCT116細胞接種裸鼠皮下10 d后，處死并取出瘤組織，干擾組與對照組腫瘤大小分別為：（0.28±0.05）cm3與（0.63±0.14）cm3，腫瘤重量分別為：（0.25±0.05）g與（0.59±0.11）g。兩組比較差異均有顯著性（P＜0.05，n＝8）。

2.3 H2S促進體外細胞增殖 外源性給予50μmol·L－1NaHS后細胞增殖，與對照組相比提高了（20.5±4.8）%（P＜0.05），給予 200μmol·L－1NaHS后促進增殖達（28.6±6.2）%（P＜0.01），差異具有顯著性。抑制內源性 CSE表達后，與對照組相比細胞增殖略有下降，差異無統計學意義（P＞0.05，n＝6）。

3 討論

結腸癌細胞中CSE含量遠大于CBS的含量［4］，因此我們設計了針對CSE的shRNA慢病毒，通過降低CSE的表達來減少了內源性H2S的產生。體外實驗中，外源性給予H2S能促進細胞增殖，但干擾內源性生成后細胞增殖無明顯變化，可能是因為在細胞培養環境中內源性產生的H2S濃度低且易擴散，導致對照組與干擾組間無明顯差異。而在裸鼠移植瘤中，干擾組明顯抑制腫瘤生長，這很可能是因為干擾組局部微環境的H2S濃度比較低，抑制了血管新生，所以腫瘤細胞生長緩慢。Szabo等［5］最近通過干擾CBS來抑制內源性H2S的生成，發現腫瘤內新血管的生成明顯減少，這證實了我們的猜想，同時也提示了CBS和CSE這兩個酶對結腸腫瘤的生長都很重要。

參考文獻：

［1］ 蔡文杰，琚立華，朱依純.硫化氫的治療性應用研究進展［J］.中國藥理學通報，2009，25（7）：854－6.

［1］ CaiW J，Ju L H，Zhu Y C.Research progress on hydrogen sulfide’s potential therapeutic use［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（7）：854－6.

［2］ CaiW J，Wang M J，Moore P K，et al.The novel proangiogenic effect of hydrogen sulfide is dependent on Akt phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2007，76（1）：29－40.

［3］ K?hn C，Dubrovska G，Huang Y，et al.Hydrogen sulfide：potent regulator of vascular tone and stimulator of angiogenesis［J］.Int J Biomed Sci，2012，8（2）：81－6.

［4］ CaiW J，Wang M J，Ju L H，et al.Hydrogen sulfide induces human colon cancer cell proliferation：role of Akt，ERK and p21［J］.Cell Biol Int，2010，34（6）：565－72.

［5］ Szabo C，Coletta C，Chao C，et al.Tumor-derived hydrogen sulfide，produced by cystathionine-β-synthase，stimulates bioenergetics，cell proliferation，and angiogenesis in colon cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（30）：12474－9.