殼聚糖緩釋微球疫苗佐劑研究進展

劉 巖，呂志強

（浙江省農業科學院蠶桑研究所,浙江杭州 310021）

殼聚糖緩釋微球疫苗佐劑研究進展

劉 巖，呂志強

（浙江省農業科學院蠶桑研究所,浙江杭州 310021）

殼聚糖高分子材料具有良好的生物和理化特性,用其制備的微球疫苗是目前緩釋疫苗佐劑的研究熱點之一。微球佐劑能保護抗原、實現緩釋作用,提高抗原利用度,促進機體免疫反應。本文圍繞殼聚糖微球的研究和應用近況進行綜述。

殼聚糖；微球；緩釋；疫苗佐劑

佐劑是指能增強機體抗原免疫應答或改變免疫應答類型的物質。它主要通過免疫調節（細胞因子網絡的修飾）、抗原遞呈（抗原構象的維持）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）誘導、抗原靶向和儲存等方式誘發機體產生長期、高效的免疫反應,提高機體保護能力,同時又減少免疫物質的用量,降低疫苗生產成本［1］。傳統疫苗多為病原體或其裂解物,免疫原性強。但隨著現代生物技術的發展,基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等新型疫苗抗原的純度越來越高,免疫原性卻通常較弱,需要使用佐劑來提高對抗原的保護作用［2］。研究安全、高效、穩定的佐劑成為學者關注的焦點,而其中緩釋微球包裹技術是近年來的研究熱點。

緩釋微球包裹技術開始于20世紀50年代,首先應用于藥物釋放系統的研究。直到1979年, Morris等［3］才首次將這項技術應用在免疫學研究,在制備微球疫苗免疫小鼠時發現,該系統可以持續釋放抗原,刺激抗體產生,而不會誘發免疫耐受,微球佐劑也才開始引起人們極大的關注。微球佐劑作為抗原的一個穩定的隔離載體,發揮著保護抗原蛋白的作用,使抗原在體內免受溫度、酸堿、滲透強度、消化液等因素的破壞,而且微球抗原還能避免母源抗體的中和作用,實現抗原可控制釋放,產生相當于常規疫苗多次接種激發的免疫效果,從而延長疫苗免疫期,減少免疫次數。目前,常用的微球載體高分子材料主要有殼聚糖、透明質酸以及海藻酸鈉等。其中,殼聚糖來源廣泛、價格低廉,體內不積蓄,無抗原免疫性,生物相容性優良等特點,使其成為一種理想的疫苗佐劑載體［4］,本文圍繞殼聚糖作為疫苗遞呈佐劑的研究和應用情況進行綜述。

1 殼聚糖的理化特征

殼聚糖是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺組成的多糖,是甲殼素脫乙酰基的產物。殼聚糖廣泛存在于蟹、蝦等低等動物以及藻類、真菌等低等植物中,含量極其豐富,是僅次于纖維素的第2大多糖［5］。殼聚糖分子基團具有1個氨基和2個羥基, pKa值約6.5,帶正電荷,不同脫乙酰度殼聚糖的分子量、黏度等有所不同。

殼聚糖主要來源于甲殼綱動物和真菌的菌絲體,以及蘑菇、藻類、酵母等。動物來源殼聚糖易受季節等波動,穩定性有不足之處［6］。菌菇來源的殼聚糖具有四季可控、穩定生產的優勢,物理提取殼聚糖與生產培養的基質密切相關。從生物安全和保健角度考慮,菌菇源的殼聚糖更優于甲殼動物來源［7］。根據來源和制備方法的不同,殼聚糖脫乙酰度在60%～100%,分子量300～1 000 ku。低聚殼聚糖可通過特定的酶或試劑降解殼聚糖制備而得［8］。

殼聚糖理化特征很難預測,通常需要先制備產品,再進行組分和特征的鑒定。作為一種天然成分,不同批次、來源的殼聚糖混合的有機和無機雜質各有不同,所以一般生產商側重介紹產品的黏度,而不是分子量；這也與殼聚糖僅溶于酸性溶液,很多項目的分析測試難以開展有關。殼聚糖的脫乙酰度常用pH電位滴定法,紅外光譜,核磁共振譜,紫外光譜,膠體滴定法和酶法降解測定［9］,分子質量則常用黏度法或色譜法測定［5］。

2 殼聚糖作為生物材料的作用特征

殼聚糖的氨基葡萄糖殘基帶正電荷,可以與唾液中帶負電荷的黏蛋白的糖蛋白結合,實現黏膜黏附作用。脫乙酰度越高,黏附作用越強,這也與殼聚糖脫乙酰后正電荷數量的增加,從而改進了黏膜黏附性能有關［10］。再者,由于殼聚糖帶正電荷,可以與細胞膜負電荷相互作用,細胞間緊密連接被打開,增加了多聚物的滲透性。這種滲透能力也隨著殼聚糖脫乙酰度的增加而增加［11］。

殼聚糖還具有抗菌活性,一種觀點認為是帶正電荷的殼聚糖可以與細胞表面負電基團相互作用后改變細胞通透性,阻礙重要物質進入細胞,和/或導致細胞必須生長物質的缺失。也有提出是細胞DNA與殼聚糖相（主要通過質子化氨基基團）結合,抑制了微生物RNA的合成［12］。此外,殼聚糖還具有抗凝血［13］、鎮痛作用［14］。

殼聚糖富含易斷裂的糖苷鍵,在體內可被多種蛋白酶降解,特別是溶菌酶［15-16］。殼聚糖聚合物的結晶度與生物降解動力學呈負相關關系。殼聚糖脫乙酰度下降至60%左右,結晶度降低而生物降解速率增加；同時,殼聚糖的乙酰基殘基也會影響它的結晶度；殼聚糖糖鏈越短,越易被降解。降解后的殼聚糖生成無毒低聚糖,經代謝后排出體外。殼聚糖的降解速率主要與脫乙酰度有關,也與N-乙酰氨基葡萄糖殘基的分布和殼聚糖分子量有關［17］。

鑒于殼聚糖所具有的良好生物降解性、降解產物無毒副作用、體內不積蓄、生物相容性優良等特點,美國食品藥品管理局已批準殼聚糖用于傷口縫合線。這些特點也決定了殼聚糖在醫藥、免疫學等領域的重要應用價值。

3 殼聚糖遞呈疫苗研究

殼聚糖微球聚合體可保護抗原免受外界不良因素（如有機溶劑,較低或較高的pH環境,蛋白酶等）的影響或破壞,為疫苗提供可靠的保障［18］。殼聚糖微球疫苗具有無毒、生物相容性和可降解性,可改變和控制抗原的釋放,提高抗原生物利用度,以及增加抗原局部滯留性等優點［19］。

殼聚糖微球可以通過乳化交聯［20］、噴霧干燥［21］、沉淀/凝聚［22］等方法制備。通過人為調控微孔大小可以控制抗原釋放的速率。一次性注射后,抗原在機體內可連續緩釋數周甚至數月,刺激機體產生持續高效抗體。

殼聚糖微球疫苗中的殼聚糖具有免疫佐劑功能和載體功能,可誘導小鼠脾細胞產生相當水平的IL2［23］,增加腸道淋巴細胞中IgA、IgG的水平［24］,激活補體、刺激巨噬細胞活化,增強吞噬能力,促進黏膜中抗原遞呈細胞對抗原的攝取［25］。殼聚糖皮下接種可以增強體液、細胞免疫反應［26］和黏膜免疫［27-28］,具有良好的開發潛力。

3.1 殼聚糖微球佐劑

3.1.1 殼聚糖DNA微球疫苗

殼聚糖的正電荷通過與DNA的負電荷相互作用,使進入體內的重組質粒DNA被Peyer集合淋巴結的M細胞捕獲,促進免疫反應的發生。殼聚糖DNA聚合物還可以保護DNA在生理鹽水或乙酸溶液中免受核酸酶降解［29-30］；而且制備安全、儲存穩定［31］。殼聚糖首次被用于遞呈質粒是在Mumper等［32］的研究報道中,Tian等［33］將魚淋巴囊腫病毒病的衣殼蛋白MCP基因的pDNA,通過乳化交聯與殼聚糖形成微球,直徑小于10μm。Soane等［34］研究發現,殼聚糖包封基因后,其半衰期由15 min延長到43 min。Rejesh Kumar等［35］制備殼聚糖包封弧菌DNA的微球疫苗能刺激石斑魚產生對弧菌的中等抵抗力。

3.1.2 殼聚糖蛋白微球疫苗

殼聚糖包裹蛋白類疫苗時,其包封率和載藥量均很高。Van der Lubben等［36］利用殼聚糖微囊包被,制備殼聚糖微球大小（4.3±0.7）μm,載藥量超過40%。4 h內超過90%仍保存在微囊內。孫慶申等［37］通過吸附法制備載牛冠狀病毒N蛋白殼聚糖微球,結果微球形態好、表面光滑、分散性較好,平均粒徑為（6.50±1.77）μm,在體內具有一定的緩釋作用。Sui等［38］用殼聚糖作為佐劑,將E.coli表達純化的M1蛋白免疫BALB/c鼠（滴鼻）,結果顯示殼聚糖蛋白混合物不僅能保護機體免受H9N2病毒的攻擊,還能保護免受70%的H1N1和30%的H5N1病毒的攻擊。

3.1.3 殼聚糖與疫苗聯合使用

殼聚糖白喉、破傷風疫苗免疫,對體液和細胞免疫均有顯著增強反應［39-40］。Rauw等［41］將新城疫疫苗與殼聚糖結合,免疫后將雞處死,取脾臟研磨,用PMA刺激細胞后,發現脾淋巴細胞增殖活性明顯增強,且IFNγ的表達量也大幅增加,外周的細胞免疫發生的時間更早、更強烈,而消化道內局部的細胞免疫相對弱一些,表明殼聚糖作為佐劑可誘導Th1型免疫反應,增強免疫效果。徐懷英等［20］利用殼聚糖為囊材制備新城疫微球疫苗,免疫試驗證實有較強的細胞免疫和體液免疫［20］。常海艷等［42］將殼聚糖與疫苗混合經腹腔注射免疫BALB/c小鼠,間隔3周,免疫2次；免疫后取血清,檢測血清中所產生的IgG,IgG1,IgG2a等抗體水平,同時取小鼠鼻洗液檢測IgA抗體；加強免疫后1周,用致死量流感病毒AP/R/8/34（H1N1）攻擊小鼠；結果表明殼聚糖作佐劑能顯著增強血清抗體IgG1和IgG2a含量,并提高小鼠抗病毒攻擊的能力,作為流感病毒滅活疫苗的新型佐劑,可以增強疫苗的抗體反應。謝勇等［43］研究表明,以殼聚糖為佐劑的幽門螺桿菌（Hp）疫苗對Hp感染具有免疫保護作用,并可成功誘導黏膜局部的特異性體液免疫應答,這可能在其免疫防御中起作用；而且可促進Thl和Th2的混合免疫反應,逆轉Hp感染所致Th2反應的抑制、使Thl和Th2反應達到平衡,從而發揮其免疫保護作用。

3.2 殼聚糖復合緩釋微球

由于殼聚糖本身的親水性、酸溶脹性等特點,單純殼聚糖形成球囊往往韌性差、降解快,作為藥用輔料效果不是非常理想［44-45］,因此,將殼聚糖與其他生物材料共混來制備微球成為該領域的新趨勢。

3.2.1 殼聚糖/海藻酸鈉

海藻酸鈉為天然高分子多糖,是一種陰離子型的共聚物,可生物降解,生物相容性好,并且具有一定的免疫佐劑作用。海藻酸鈉易與二價陽離子交聯固化,利用這一特性,可通過噴霧干燥和離子交聯法制備海藻酸鈉微球［46］。由于殼聚糖分子鏈上有大量的氨基,海藻酸鈉分子鏈上有大量的羧基,所以殼聚糖和海藻酸鈉可通過正、負電荷吸引形成聚電解質膜,從而提高微囊的穩定性和載藥量,并可調節藥物釋放速度［47］。王毅超等［48］以殼聚糖、海藻酸鈉為主要材料包裹Hp全菌超聲蛋白抗原,制備新型Hp疫苗制劑,所制備的微球形態規則,平均粒徑3.33μm,蛋白包封率約為64.8%,微球呈顯著緩釋模式,緩釋時間可達6 d。Ma等［49］通過殼聚糖-海藻酸鈉-CaCl2系統制備噬菌體Felix O1微囊,體外模擬胃液、膽汁鹽環境,Felix O1在pH值低于3.7下5 min即被降解；相反,微囊包被組在pH值2.4胃酸條件下處理1 h,也僅僅降低2.58個對數單位；在1%和2%膽汁溶液中處理3 h分別降低1.29和1.67個對數單位；干燥微囊貯存6周后,噬菌體仍有12.6%的存活率,這為今后胃腸道免疫應用提供了方便。

3.2.2 殼聚糖/聚乙丙交酯

聚乙丙交酯（PLGA）是由乳酸（lactic acid, LA）與羥基乙酸（glycolic acid,GA）共聚合而成。降解時酯鍵發生水解,大分子鏈逐漸斷裂成低分子聚合物,最終經GA、LA生成CO2和H2O等產物。PLGA有很好的穩定性和安全性,易于被吞噬細胞攝取,可通過在顆粒表面吸附相應的配體定位到特定的組織或器官。但PLGA微球包封藥物突釋現象明顯,這與藥物主要分布在微球表面有關。由于殼聚糖有效的緩沖作用,研究者制備PLGA/ CS復合微球可避免PLGA微球引起的pH值的下降,減輕微球突釋現象［50］。Wang等［51］通過PLGA/CS形成復合微球,發現CS涂層是一種有效控制PLGA微球初始突發釋放蛋白質的方法,也有助于克服了酸性蛋白加載PLGA微球,因此研究人員嘗試通過涂層防止藥物-聚合物過早分離。

3.2.3 殼聚糖/絲素蛋白復合微囊

絲素蛋白是家蠶幼蟲產生的,由18種氨基酸組成,無毒、無刺激,具有良好的物理、化學、生物學性能,它沒有免疫反應,具有良好的血液、組織相容性和抗凝血性。絲素蛋白膠凝凍結棚架評估微結構形態與掃描電子顯微鏡揭示相對均勻的孔結構和良好的互聯互通性［52］。Yeo等［53］利用spray dryer方法制備絲素微球。絲素中含有豐富的酰胺基和少量羥基,絲素蛋白的羧基在pH值4.2以上帶負電荷［54-55］,可與殼聚糖形成氫鍵,破壞殼聚糖鏈本身之間的復合凝聚,在共混膜方面已有研究報道［56］。Deveci等［57］利用復凝聚法制備絲素蛋白與殼聚糖的復合微囊,兩者比例為5時能形成表面光滑的微球。比例大于14時,微球有2層結構,內層致密,外層多孔。劉純等［58］以絲素蛋白、殼聚糖為載體材料,雙氯芬酸鈉為模型藥物,制備微球并考察其性質及體外釋放；載藥微球平均粒徑（26.54±1.39）μm,且大小在20～30μm的微球占總數的81.47%。釋放時間可以持續200 h,緩釋效果較單一的殼聚糖微球好。來水利等［59］以胰島素為目標藥物,以絲素（SF）和羥丙基殼聚糖（HPCS）為包藥材料,用復凝聚法制備SF-HPCS載藥微球；平均粒徑22.4μm,48 h內釋藥率92.2%。Chung等［60］利用CS和SF在TPP作用下,采用spray-diried方法制備多孔微囊用于藥物緩釋。作者實驗室利用殼聚糖、絲素蛋白2種材料,首次制備了荷載IBDV多聚蛋白基因的復合微囊,經動物試驗對防治雞傳染性法氏囊病有較好的免疫效果,為疫苗佐劑的開發提供了新的參考。

此外,張燦等［61］將具有肝靶向作用的半乳糖和殼聚糖偶聯,制備N-乳糖酰化殼聚糖,并對其性能進行了研究,認為該復合制劑有望成為新型的肝靶向藥物載體。Sun等［62］報道,發現殼聚糖/脂質體包封質粒DNA后的拷貝數增加更明顯。Zheng等［63］用海藻酸-殼聚糖共混后,再與PLGA制備3層復合微球,發現復合微球承載能力是常規PLGA微球的7倍多,復合微球疫苗誘導更強的免疫功能。

4 展望

殼聚糖具有特殊的生物、理化性質,是一種極有潛力的新型疫苗佐劑,近年來對它的研究取得了很大進展。但是從應用程度來講,多數仍停留在實驗室階段。今后,如何改善殼聚糖親水性、選擇安全適合的改性材料、減少制備工藝對疫苗穩定性的影響、實現制備工藝的重現性和放大生產等等,這些問題都有待于進一步的研究解決。總之,隨著微球佐劑研究的不斷深入,以及相關學科技術的不斷發展完善,可以相信在不久的將來,殼聚糖等微球疫苗佐劑必將在疫病防治中發揮重要的功效。

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（責任編輯：張才德）

S 88

A

0528-9017（2014）03-0416-05

文獻著錄格式：劉巖,呂志強.殼聚糖緩釋微球疫苗佐劑研究進展［J］.浙江農業科學,2014（3）：416-420,424.

2013-12-09

浙江省自然科學基金（Y3110544）；浙江省農業科學院重點實驗室開放課題

劉 巖（1976-）,女,河南焦作人,副研究員,博士,從事桑蠶基礎研究工作。