絞股藍皂甙對2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞核因子-1α的影響

賀 琴 李德梅 譚華炳

(湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北 十堰 442000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是2型糖尿病(T2DM)主要并發癥之一，T2DM患者NAFLD檢出率為50.45%〔1〕。NAFLD導致高脂血癥、動脈粥樣硬化、T2DM〔2～4〕。絞股藍及絞股藍皂甙(GPS)能夠降低NAFLD兔肝臟脂質沉積量〔5〕，有治療T2DM、代謝綜合征(MS)作用〔6，7〕。本研究通過高脂飼料飼養聯合鏈脲佐菌素(STZ)注射建立T2DM并NAFLD大鼠模型，觀察GPS對T2DM并NAFLD大鼠肝細胞核因子(HNF)-1α的影響，探討GPS是否是通過干預HNF-1α達到防治T2DM并NAFLD的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 65只SPF級雄性SD大鼠，體質量220～250 g，由湖北醫藥學院動物實驗中心提供〔合格證號：No.scxk(湘)2009-0004〕。實驗場地湖北省十堰市實驗動物中心(湖北省實驗動物設施使用證明號：00015644)。

1.2實驗飼料 普通飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成，蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按實驗配方配制成成品使用(配方：78%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按照實驗設計配方配制成成品使用(配方：82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3實驗模型建立

1.3.1實驗動物的分組 SD大鼠購入后，普通飼料飼養觀察1 w，動物無死亡及不良反應。按照實驗設計將65只大鼠分為空白對照組(7只，N組)，NAFLD模型組(NM組，7只)，T2DM并NAFLD模型組(51只)。

1.3.2T2DM并NAFLD造模與干預 參照文獻〔9〕，每鼠每天高糖高脂飼料20 g左右，分兩次投入，喂養4周；大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)40 mg/kg，48 h后尾靜脈取血，血糖>11.1 mmol/L，納入實驗組，造模成功率為100%；繼續給予高糖高脂飼料喂養至8 w，建立T2DM并NAFLD模型。期間大鼠死亡15只。將全部大鼠分為GPS大劑量組(9只，JH組)，給予GPS 1 g·kg-1·d-1灌胃；GPS小劑量組(9只，JL組)，給予GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃；T2DM并NAFLD模型對照組(9只，M組)同等體積的純凈水灌胃；繼續給予高糖高脂飼料，自由飲水；治療周期為6 w；實驗周期14 w。

1.3.3N組、NM組飼養與管理 N組每天給予普通飼料20 g左右(根據NAFLD組進食量調整)；MN組給予高脂飼料20 g左右(依據前一天進食量決定第二天進食量)；飼料分2次投入。自由飲水。實驗周期14 w。

1.4肝臟病理學檢測 在肝臟最大葉，取肝組織0.5 cm，常規規定、切片、HE染色，檢測肝臟病理學變化。

1.5常規實驗材料和設備 STZ購于美國Sigma公司。GPS購自安康東科麥迪森天然藥業有限公司，純度為98%。Olympus DP-70顯微攝影系統(日本，奧林巴斯公司)。

1.6HNF-1α檢測設備、試劑、方法

1.6.1檢測設備、試劑 Heal Force離心機(臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R)。PCR儀(Hangzhou Bioer Teechnology Co.，LTD；Life express Thermal Cycler)。熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司，SLAN熒光定量PCR檢測系統)；超凈工作臺(蘇凈安泰公司，SW-CJ-1FD)。總RNA提取試劑Trizol Reagent(15596-026，Invitrogen Life Technologies生產)；離心管、TIP頭均購自Axygen Biosciences公司。ReverTra Ace-α反轉錄(TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit，FSK-100)。實時熒光定量PCR(TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，QPS-201)。引物由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國公司合成。

1.6.2檢測方法 總RNA抽提(取勻漿器，加入1 ml的Trizol試劑，置冰上預冷；取100 mg組織，加入到勻漿器中；充分研磨直至無可見組織塊；加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min；4℃離心8 min；將上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻；-20℃放置15 min；4℃離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA；吸除液體，加入75%乙醇1.5 ml洗滌沉淀；4℃離心5 min；將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3 min；加入20 μl無RNA酶的水溶解RNA。反轉錄:取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液；加入1 μl oligo(dT)15；用無核糖核酸酶的去離子水補足至12 μl；于PCR儀上70℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻；依次加入4 μl 5倍緩沖液，2 μl 10 mmol/L dNTPs，1 μl RNA抑制劑和1 μl反轉錄酶，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫30 min，結束后80℃保溫5 min滅活反轉錄酶)。定量PCR(取0.2 ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管，2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L基因引物 2.0 μl，反轉錄產物 2.0 μl，ddH2O 8.5 μl；取0.2 ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管，2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L內標引物 2.0 μl，反轉錄產物 2.0 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR擴增：預變性 95℃ 1 min，循環(40次) 95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，20 s，末段延 72℃ 5 min，溶解曲線 72℃→95℃，每20 s升溫1℃。

1.7統計學方法 采用SPSS9.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1實驗過程中大鼠數量變化 同文獻〔9，10〕，模型組在T2DM并NAFLD造模過程中，死亡大鼠15只，死亡率為29.41%；在干預過程中，JH、JL、M組分別有1、2、3只大鼠死亡，實驗結束JH組實有大鼠8只，JL組實有大鼠7只，M組實有大鼠6只。NM組實驗過程中死亡1只，實有大鼠6只。N組大鼠飼養過程中無死亡。實驗開始有大鼠65只，實驗結束實有大鼠34只。

2.2HNF-1α變化 以N組擴增倍數為1計算，MN組HNF-1α表達為0.85，與N組比較有顯著差異(P<0.05)；M組為0.62，與N組比較有顯著差異(P<0.01)；JH治療組HNF-1α升至0.80，與M組比較有顯著差異(P<0.01)；JL治療組HNF-1α升至0.68，與M組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.3肝臟病理學 N組為正常肝臟，NM組為重度脂肪肝，M組脂肪肝程度最嚴重；JL組與NM組程度相似；JH組脂肪肝程度最輕。

3 討 論

T2DM由于與NAFLD在發病機制上存在“共同土壤”胰島素抵抗(IR)而成為其重要病因〔11〕。HNF-1α是調控許多肝功能基因表達的重要轉錄因子，對促進肝臟發育和維護肝細胞生物學功能發揮重要作用〔11〕。HNF-1α在肝臟內高水平表達，參與肝臟糖、脂代謝相關基因特異性表達的調控〔10〕。HNF-1α是否參與T2DM并NAFLD的發病，以及GPS是否是通過影響HNF-1α達到治療目的，是本研究關注的問題。研究顯示T2DM并NAFLD大鼠糖脂代謝能力下降，肝細胞其他生理學功能下降，加重糖尿病和NAFLD發展。GPS對T2DM并NAFLD大鼠HNF-1α定下降具有干預作用，從而改善糖脂代謝，打斷惡性循環。至于GPS通過何途徑抑制HNF-1α有待進一步研究。中醫認為T2DM合并NAFLD是由于濕熱內蘊、痰瘀互結。現代藥理研究證明絞股藍含有83種與人參皂甙有類似骨架的達瑪烷型絞股藍皂甙，皂甙具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調節等多方面的生物活性和藥理作用〔11〕，Norberg等〔12〕從絞股藍中分離提純出一種新的皂甙，存在4種可以相互轉化的立體異構體，在體外及動物實驗中均發現，其可刺激胰島細胞釋放胰島素，且呈現劑量依賴性。Xu等〔13〕發現其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度。本研究提示，GPS具有多靶點干預T2DM并NAFLD作用，在防治T2DM并NAFLD方面具有一定的優勢。本研究提示，GPS通過調整肝組織HNF-1α表達，對T2DM并NAFLD具有治療作用，結合既往研究說明GPS多靶點治療T2DM并NAFLD。

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