魏氏梭菌α毒素分子生物學研究進展

宮語晨，許崇利，錢愛東*，許崇波

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118;2.吉林化工學院化工與生物技術學院，吉林吉林132022;3.大連大學醫學院，遼寧大連1166222)

魏氏梭菌是一種革蘭陽性厭氧桿菌，根據其產生的4種主要毒素α毒素(CPA)、β毒素(CPB)、ε毒素(ETX)和 ι毒素(ITX)，將其分為 A、B、C、D 和E 5種毒素型。然而這種細菌在不同毒素型中可以產生至少16種毒素，如魏氏梭菌θ毒素(又稱裂解素 O，PFO)、腸毒素(CPE)和β2毒素(CPB2)等致命毒素。多數情況下，魏氏梭菌引起的疾病是由一種或多種魏氏梭菌致病毒素所致［1－2］。各型魏氏梭菌均產生α毒素，它是魏氏梭菌最重要的致病毒素之一，而且也是A型魏氏梭菌最主要的毒力因子［3－4］。為此本文對α毒素的生物學特性及作用機制等方面進行了綜述，以便為其相關研究提供參考。

1 α毒素的生物學特性

魏氏梭菌廣泛分布于土壤、水、食物、人畜腸道中，侵入患者傷口后，由于受損部位缺血造成缺氧，組織氧化電勢(Eh)下降，使其得以生長繁殖;同時往往與需氧菌混合感染，消耗組織內氧氣，使Eh進一步降低，而細菌本身分解糖類產生的大量氣體壓迫血管，更加重組織的缺血缺氧，諸多因素均造成組織內低Eh環境，更利于該菌的生長繁殖，產生大量的α毒素［5－6］。α毒素具有細胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性［7－8］。α 毒素分子量約為43 kDa，通過比對 α毒素基因和磷脂酶 C(Phospholipase C，PLC)基因的核苷酸序列，結果表明α毒素與這種酶N端大約250個殘基有很強的同源性［9－10］。此外α毒素的C末端還有一個120個殘基的額外結構域。這些發現說明α毒素屬于PLC家族［11－12］。由于α毒素能水解卵磷脂的C鏈，產生磷酰膽堿和甘油二脂，故又稱為PLC。對α毒素進行的晶體分析顯示，它的結構可以分成兩個區域:N端區域，有9個緊緊壓縮的α螺旋;C端結構域包含8個反平行的β折疊層。N端含有3個包含鋅離子的活性位點。而且含有鋅離子的氨基酸殘基對酶的活性十分重要。混合α毒素C端和N端可恢復其溶血活性，表明C端影響著N端的活性［13］。研究表明，C端結構域的折疊與突觸結合蛋白等真核磷脂結合蛋白的“C2”結構域及其類似結構相似。在信號轉導中發揮重要作用的真核蛋白也包含類似結構域;269位和336位的天冬氨酸與鈣離子的特異性相互作用有關［14－15］。此外，275位、307 位和 331位的酪氨酸對α毒素的結合起關鍵作用。C端結構域可能在與細胞膜的結合中扮演重要角色［16］。

α毒素可裂解由磷脂酰膽堿(PC)或鞘磷脂(SM)組成的脂質體，從而使羧基熒光素(CF)和磷酸膽堿釋放出來。隨著脂質體相變溫度的升高，羧基熒光素(CF)釋放減少，這表明，脂質體對α毒素的敏感性與相變溫度有很大的關系［17］。而且α毒素結合脂質體和α毒素導致的脂質體中的磷脂酰膽堿(PC)的水解都與脂質體中磷脂酰膽堿(PC)的相變溫度有關。由此可見，α毒素對膜的裂解作用同脂質體的流動性息息相關。6－丙烯酰－2－二甲基氨基萘標記的C端結構域與脂質體結合并出現顯著的藍色偏移。這表明C端結構域插入到脂質體中的疏水區，也說明α毒素對生物膜的破壞作用依賴于膜的流動性，而且這種破壞作用依賴于C端結構域插入到膜脂雙分子層中。

2 α毒素基因的克隆和分析

α毒素的編碼基因位于染色體上的復制起始區并且毗連rrnA基因。該區域是細菌染色體上最穩定的區域之一。α毒素基因首次從產生高水平α毒素的A型魏氏梭菌中被克隆并測定了其核苷酸序列［18－19］。α毒素基因已經在大腸桿菌中實現了高效表達，在卵黃瓊脂培養基上其菌落周圍產生了渾濁區域，而在含有紅細胞的瓊脂培養基上產生了溶血效應。核苷酸測序表明其含有一個包括原核信號序列的開放閱讀框。大腸桿菌中表達的α毒素蓄積在周質空間也表明這一信號序列的存在。另外在魏氏梭菌的培養上清液中純化出了α毒素蛋白進一步證實了上述觀點［20］。隨后從魏氏梭菌其他菌株里也克隆出α毒素基因并揭示了其生物學特征。這些α毒素基因都位于染色體上的復制起始區，并且平均有1.3%的核苷酸序列不同。

3 α毒素對細胞和生物膜的作用

高濃度的α毒素可大量水解生物膜上磷脂酰膽堿和鞘磷脂。然而，低濃度的α毒素只能少量水解磷脂酰膽堿和鞘磷脂并且產生二酰甘油和神經酰胺。這些反應會激活多種信號傳遞途徑。從而產生多種胞間介質。α毒素也可激活生物膜上的磷脂代謝導致鼠腸和動脈組織的痙攣［21－22］。而且α毒素還可激活小鼠主動脈中花生四烯酸的級聯反應［23］。研究表明α毒素引起的痙攣與花生四烯酸變成血栓素A2有很大關系。最近又有報道稱，其他微生物產生磷脂酶 C也有類似現象［24］。因此，很可能細菌中的磷脂酶C模擬真核生物細胞膜中磷脂酶C的作用。

α毒素可誘導產生細胞胞間介質、細胞間黏附分子1(ICAM－1)、白介素 －8(IL－8)，腫瘤壞死因子－α(TNF－α)，血小板活化因子(PAF)和內皮細胞白細胞黏附因子(LECAM)［25］。這些胞間因子的產生進一步增加了血管的滲透性和水腫［26］。α毒素使血小板纖維蛋白原受體發生了易位，使其從血小板內部轉到外膜，同時使血小板發生了凝集［27－28］。此外，在 α 毒素、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)和干擾素－γ(IFN－γ)分別作用下，細胞發生了相類似的形態學改變［25］。

4 α毒素的表達調控

早期從氣性壞疽病人體內分離到的魏氏梭菌產生的α毒素水平比較低，所以并不能闡明α毒素在疾病中扮演的角色。α毒素表達差異主要是由于α毒素基因的轉錄調控［29－30］。雖然α毒素在體內的表達可能是被正調控的，但是有必要揭示出α毒素基因的調控機制。指導α毒素基因轉錄的啟動子包括－10和－35保守區，位于SD序列的上游。雖然α毒素基因的調控位點還沒有被鑒定出來，但是位于－35保守區上游的多個重復A堿基對于α毒素基因表達起著關鍵作［31－32］。和其他致病菌一樣，魏氏梭菌通過VirR/VirS雙組分調控系統來調控基因的表達［33－34］。VirS作為組氨酸激酶傳感器，對環境信號做出應答，從而磷酸化VirR，磷酸化的VirR調控靶基因的轉錄。對于調控VirR/VirS功能環境因素的鑒別不但能使我們充分理解細菌在傷口中上調α毒素的水平，而且也能更好地解釋在健康人腸道中α毒素表達被下調，而在某些疾病條件下被上調的原因。

5 α毒素與疾病

魏氏梭菌是人和動物多種疾病主要的致病因子。A型魏氏梭菌可引起傷口氣性壞疽。氣性壞疽是一種嚴重的創傷感染性疾病，多見于軟組織嚴重開放性損傷。另外少數腸道手術后由于腸內容物的污染也可以引起氣性壞疽［35］。但并不是所有傷口感染了魏氏梭菌都會引起氣性壞疽。氣性壞疽病的發生，并不單純地取決于魏氏梭菌的存在，更決定于人體抵抗力和傷口的情況，即需要一個有利于魏氏梭菌生長繁殖的缺氧環境。因此，失水、失血或休克，而又有傷口的大片組織壞死、深層肌肉損毀，容易發生氣性壞疽病。

實驗證明氣性壞疽主要是由魏氏梭菌產生的α毒素引起的。首先滅活α毒素基因的魏氏梭菌突變株在氣性壞疽的鼠模型中大大減少。其次用α類毒素免疫的小鼠可以有效抵抗氣性壞疽病。α毒素感染創傷面以后，破壞局部組織和炎癥細胞;當毒素浸潤至周圍組織或進入全身循環系統后，可引起中性粒細胞和內皮細胞間黏附作用的調節異常并上調白細胞的呼吸爆發，導致血管內白細胞淤滯、內皮細胞受損和局部組織缺氧。組織的灌注不足有利于厭氧菌的生長，使氣性壞疽的病變范圍迅速擴大。此外，α毒素還可引起嚴重的溶血和組織壞死。休克的發生與毒素的直接和間接作用有關。在體外試驗中，α毒素可直接抑制心肌的收縮力，可因心輸出量的急劇減少而造成低血壓。

6 展望

雖然已經揭示了α毒素在氣性壞疽中的作用機理，但在人和動物非壞疽性疾病中的作用機制并沒有被完全闡明。動物中許多疾病的發生都與α毒素息息相關，尤其是α毒素能降低飼料中抗生素的水平。目前急需揭示α毒素在這些疾病中的作用機理，同時評價α毒素疫苗在預防這些疾病中的效果。為了支持這些研究，有必要闡明α毒素基因的調控機制，進一步了解環境因素刺激能否上調腸道和宿主組織中α毒素的產量，對于α毒素毒力分子基礎的了解，使我們能夠解釋α毒素和細胞膜相互作用的機制。然而仍舊有許多問題需要做進一步的研究，比如底物特異性的分子基礎是什么，細胞膜是怎樣把磷脂填充到活性位點的，這些問題的解答有助于α毒素抑制劑在臨床上的應用，尤其希望能開發出利用α毒素的抗腫瘤藥物。

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