獸藥殘留檢測技術應用現狀及發展方向

黃雪英，沈 丹

(廣州市動物衛生監督所，廣州510440)

獸藥是現代畜牧業生產中不可缺少的物質基礎，在生產實踐中，卻經常被誤用或濫用而造成畜禽產品獸藥殘留超標。從1999年開始，農業部開始在全國范圍組織實施國家獸藥殘留監控計劃，主要監測我國禁用獸藥和常用獸藥，經過十幾年的努力，總體呈好轉趨勢［1］。但近幾年的監控結果顯示，在畜禽產品中仍然有磺胺類、四環素類、氟喹諾酮類等獸藥殘留超標現象，甚至有的樣品中還檢出了違禁物質如氯霉素和硝基呋喃代謝物。殘留的獸藥會影響動物產品品質，危害消費者身體健康，對人造成中毒反應、過敏反應，甚至引起“三致作用”［2］。獸藥殘留檢測作為控制藥物殘留的重要手段和方法，已成為畜禽產品質量安全的有力保證。針對獸藥殘留的檢測，國內外通用的做法是先用“快速篩查方法”初篩檢測，再用“確證檢測方法”確證檢測［3］。初篩方法要求容易使用、高流通量、運行成本低、能夠快速獲得結果。確證方法則要求靈敏度高、定性無差錯、定量準確。本文對主要的獸藥殘留檢測技術及其應用現狀進行了介紹，并對獸藥殘留檢測技術在未來的發展方向進行了展望，以期為研究更高效的檢測方法提供參考。

1 快速篩查方法

目前針對畜禽產品獸藥殘留的“快速篩查方法”主要有酶聯免疫吸附法、膠體金免疫層析法、生物傳感器、高效液相色譜法和高效薄層色譜法等。

1.1 酶聯免疫吸附法(ELISA)ELISA是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合起來的一種檢測技術，一般將抗原或抗體吸附于固相載體進行免疫酶反應，經底物顯色后用酶標儀進行檢測。ELISA方法操作簡單、靈敏度和特異性高，可同時進行大批量樣品檢測，已廣泛用作獸藥殘留檢測的快速篩選方法。Jiang等［4］用ELISA方法檢測豬肉、雞肉等動物組織中呋喃妥因代謝物，在 0.2 ～5 μg/kg水平上的回收率為75% ～116.7%。用ELISA測定動物組織中的慶大霉素殘留，在8、20和50 mg/kg水平上的回收率為69% ～118%［5］。張澤英［6］列出了近 3 年(2010 至2013年)國內外有關抗微生物類獸藥殘留ELISA檢測方法的應用情況，檢測藥物包括氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、β－內酰胺類、四環素類、大環內酯類等獸藥。徐偉等［7］綜述了ELISA檢測在動物產品中的應用，對呋喃它酮代謝物、四環素類、磺胺類、苯巴比妥、己烯雌酚、氯霉素、黃曲霉素等藥物進行檢測，發現這些檢測都表現出了高的靈敏度和準確度。可見目前幾乎所有常見的獸藥殘留都已經建立了ELISA檢測方法，ELISA已經廣泛應用于各類獸藥殘留的快速檢測。

1.2 膠體金免疫層析法(GICA)GICA是以膠體金為標記物的免疫層析方法，它多以條狀纖維層析材料(通稱試紙條)為固相載體，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上橫向流動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)結合，再通過膠體金結合物達到檢測目的。該方法操作簡單、可現場檢測、成本低、不需儀器、幾分鐘即可出結果。Jiang等［8］用該方法檢測了豬肉和牛肉中的19－去甲睪酮殘留，檢測限可達2 μg/kg。萬宇平等［9］研制了一種快速檢測牛奶中的氟喹諾酮類藥物試紙卡，并配合膠體金試紙卡讀數儀使用，可以檢測恩諾沙星、沙拉沙星、環丙沙星等十余種氟喹諾酮藥物，檢測限為20～40 μg/L。薛曉等［10］介紹了GICA在畜禽產品獸藥殘留檢測中的研究應用，包括抗生素類、磺胺類，呋喃類、β－興奮劑等藥物殘留檢測。目前已有市售的氯霉素、克倫特羅、萊克多巴胺等多種試紙條經農業部備案，用GICA測定孔雀石綠、三聚氰胺、慶大霉素等也都已見報道。

1.3 生物傳感器 生物傳感器的構成包括生物敏感部件和換能器，樣品中被分析物與生物敏感部件作用，發生生物學反應，產生的生物化學信號被相應的換能器轉變為可定量處理的電信號，進一步用適當的儀器分析，便可測得被分析物的結果。獸藥殘留檢測通常采用基于表面等離子體共振技術的生物傳感器進行檢測，劉瑾等［11］采用表面等離子共振生物傳感器檢測牛奶中的氨芐青霉素殘留，對牛奶溶液檢測最低檢測限為1.8 ng/mL。生物傳感器在抗生素、β－受體激動劑和抗寄生蟲藥物等獸藥殘留檢測應用領域發展迅速［12］。白冰等［13］介紹了生物傳感器在四環素、土霉素、對苯二酚和鹽酸克倫特羅等殘留檢測方面的應用。與傳統的檢測方法相比，生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、響應快、易于操作、高通量及適合現場檢測等優點［14］，已成功應用于對肉類食品中的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、鏈霉素、氯霉素、恩諾沙星、環丙沙星、伊維菌素、西瑪三嗪、青霉素G、頭孢菌素、孕酮、泰樂菌素等藥物的檢測［15］。

1.4 高效液相色譜法(HPLC)HPLC由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器等部件構成，溶于流動相的各組分經高壓輸液泵泵入系統，經過色譜柱時，各組分由于與固定相發生作用的大小強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而達到分離檢測的目的。各種性能的色譜柱、不同種類的檢測器和自動化的可行性(進樣、洗脫、檢測等)在某種程度上促進了HPLC作為快速篩查技術的使用，它分離效能高、方法穩定、精確度高，是目前大多數獸藥殘留的常規分析方法。Milagro等［16］介紹了HPLC用于快速篩查檢測肉品中生長促進劑殘留量的應用。我國已經出臺了一系列的應用HPLC檢測獸藥殘留的標準方法，可用于檢測四環素類、β－內酰胺類、硝基咪唑類、大環內酯類、磺胺類、激素類等幾乎所有常見的獸藥殘留的檢測。近年來，超高效液相色譜的應用也日益廣泛，超高效液相色譜比液相色譜具有更高的分離度、分析速度和靈敏度，周春鳳等［17］介紹了超高效液相色譜技術在獸藥分析領域應用中的研究。

1.5 高效薄層色譜法(HPTLC) 薄層色譜(TLC)和柱色譜在分離原理上基本相同，將樣品點在以多孔吸附劑為載體的固定相上，流動相利用毛細管作用將樣品中不同組分推移到不同距離處而分離，色譜可用肉眼或使用光密度計和照相機記錄或用影像系統方法來評價。TLC簡便快速、可同時測定多個樣品，但重現性不好，靈敏度和分辨率遠遠不及HPLC。HPTLC改進了點樣技術、板技術，提高了檢測靈敏度，保持了TLC的優點，可以同時檢測多個樣品，分析時間短。劉雪紅等［18］建立了雞肉中磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹惡啉多殘留檢測的薄層色譜法，三種藥物分離良好，斑點顯色清晰且無干擾，回收率約為60%，檢測限為0.05 μg/mL。現代的HPTLC實現了高水平的自動化，可以同時定量檢測肉品中的多殘留，但是由于其他檢測技術(如HPLC)使用范圍的擴大，在化學藥物檢測方面，它的使用迅速減少［19］。由于固定相(吸附劑)相對價廉，即用即棄，不必擔心樣品污染，檢測不受溶劑干擾，色譜直觀性強，在中獸藥快速篩查檢測方面被廣泛使用［20］。

其他快速檢測技術還有微生物抑制測定法、量子點標記熒光檢測法、熒光偏振免疫檢測法、化學發光免疫檢測法、電化學免疫分析法等，這些快速檢測技術也可以滿足對大量樣品檢測、縮短檢測周期、降低檢測費用的需求，也是未來的發展趨勢［21］。

2 確證檢測方法

確證檢測方法多是應用色譜－質譜聯用技術，將色譜的高效分離能力和質譜強大的定性能力相結合，成為目前獸藥殘留分析領域中最強大、最有力的定性定量工具，主要應用有氣相色譜－質譜聯用(GC－MS)和液相色譜－質譜聯用(LC－MS)。此外高效毛細管電泳和質譜聯用(CE－MS)，測定結果準確可靠，也可用于確證檢測。

2.1 氣相色譜－質譜法(GC－MS)GC－MS分析中樣品經GC進樣，高溫瞬間汽化后，經色譜柱分離，進MS檢測器測定，常用于復雜樣品的痕量分析。GC－MS具有分析速度快、分離效率高、靈敏度高、穩定性好等諸多優點。田苗［22］建立了豬組織中10種β－興奮劑類獸藥殘留量的檢測方法，檢出限、回收率和精密度等技術指標均能滿足要求。王麗娜等［23］建立測定豬肉中己烯雌酚、雌二醇、炔雌醇、戊酸雌二醇殘留量的GC－MS法，平均回收率為78.3% ～82.5%(RSD為4.4% ～9.6%)。GC－MS適用于分析易揮發的小分子有機物，不適合分析沸點高、極性大、熱不穩定的化合物。由于大多數獸藥是極性和沸點較高的化合物，因此用GC－MS進行獸藥殘留檢測前通常需衍生化處理，步驟較繁瑣，這使GC－MS在獸藥分析中的應用受到一定限制。

2.2 液相色譜－質譜法(LC－MS)LC－MS以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統，適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩定性差的獸藥殘留分析，也是目前獸藥殘留檢測中最強有力的工具。李丹等［24］建立了豬尿中西馬特羅、特步他林等20種β－受體激動劑殘留檢測的超高效液相色譜－串聯質譜法，檢測限均可低至0.25 μg/L，回收率為75.7% ～110.7%。FU 等［25］總結了用液相色譜 －串聯質譜在檢測飼料、動物產品及尿液中獸藥的應用狀況。王俊菊等［26］綜述了近年來高效液相色譜－質譜聯用技術在抗生素、抗球蟲和激素類藥物殘留分析中的應用進展。目前LC－MS已被報道應用在磺胺類、四環素類、大環內酯類、阿維菌素類、β－內酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素類、喹諾酮類、硝基呋喃類、激素類、β－受體激動劑、苯并咪唑類、三嗪類等幾乎所有種類的獸藥殘留分析中［27］。

LC－MS不僅用于檢測同類獸藥多組分殘留，還用于測定不同種類獸藥多組分殘留［28－31］，這也是近年來的研究方向和熱點，目前應用研究已經取得一定進展。郭德華等［32］建立了同時測定動物源性食品中76種獸藥殘留的檢測方法，Zhan等［33］定量分析了不同類別226種獸藥和其他污染物在豬和牛肌肉中的殘留量。但還存在不少問題，如前處理方法復雜，有待優化，檢測結果準確度、精密度不夠好，有待提高等。

2.3 毛細管電泳－質譜法(CE－MS) 以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，不同組分在高壓電場的作用下遷移速率不同，從而實現各組分分離，再經質譜檢測。毛細管電泳樣品用量少、分離效果好、分析速度快;和質譜聯用，方法靈敏度高、特異性強，測定結果準確可靠，可用于畜禽產品中獸藥殘留的確證性檢測。顏流水等［34］用毛細管電泳－質譜聯用分離分析豬肝中的克倫特羅和沙丁胺醇，電泳分離時間小于6 min，檢出限分別為0.4 和0.3 μg/kg。Blasco 等［35］應用 CE－MS/MS 檢測技術測定牛奶樣品中2種喹諾酮類和6種磺胺類獸藥多殘留，回收率均在78%以上，RSD%小于15%。付石軍等［36］綜述了毛細管電泳技術在畜產品中抗生素、抗菌藥物、激素及違禁藥物等殘留檢測的應用現狀。

3 展望

隨著獸藥殘留檢測技術的不斷更新和完善，檢測方法也不斷向著快速、準確、高效的方向發展。為了便于基層開展工作，開發便攜簡單的快速檢測產品，進一步提高檢測靈敏度和檢測范圍，同時實現多種成分的檢測，建立快速準確、高通量、現場篩查的方法，應是今后“快速篩查方法”發展的趨勢。而對于“確證檢測方法”，簡化復雜樣品前處理步驟，建立通用性的樣品制備方法，提高樣品制備自動化程度，增加樣品通量，提高檢測靈敏度，將是今后的發展方向。隨著各種檢測方法的發展融合，將來的檢測方法可以既是快速篩查方法，同時也是確證方法，如在線固相萃取(SPE)與色譜質譜聯用，可以同時對樣品進行確認篩選，雖然儀器成本很高，但是當進行大量樣品分析時，檢測效率將高過快篩與確證方法的結合使用，從而可以降低成本，更加具有競爭力。

［1］馮忠澤.我國獸藥殘留監控工作發展現狀與思考［J］.中國獸藥雜志，2009，43(6):1－3.

［2］姜 秋.肉品中獸藥殘留的來源、危害及檢測技術［J］.肉類工業，2012，(3):44－47.

［3］Shankar B P，Manjunatha Prabhu B H，Chandan S，et al.Rapid methods for detection of veterinary drug residues in meat［J］.Veterinary World，2010，3(5):241－246.

［4］Wenxiao Jiang，Pengjie Luo，Xia Wang，et al.Development of an enzyme－linked immunosorbent assay for the detection of nitrofurantoin metabolite，1－amino－hydantoin，in animal tissues［J］.Food Control，2012，23(1):20 －25.

［5］Wei Sheng，Li Yang ，Junping Wang，et al.Development of an enzyme－linked immunosorbent assay for the detection of gentamycin residues in animal－ derived foods［J］.LWT－Food Science and Technology，2013，50(1):204 －209.

［6］張澤英.酶聯免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用［J］.湖北畜牧獸醫，2013，34(10):59－61.

［7］徐 偉，程鳳科，孟 銀，等.酶聯免疫吸附法在獸藥殘留檢測中的應用［J］.中國家禽，2013，35(12):49－52.

［8］Jinqing Jiang，Ziliang Wang，Haitang Zhang，et al.Monoclonal antibody－based ELISA and colloidal gold immunoassay for detecting 19－nortestosterone residue in animal tissues［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(18):9763－9769.

［9］萬宇平，劉清珺，賈芳芳，等.一種快速檢測氟喹諾酮類藥物的膠體金試紙卡的研制［J］.中國乳品工業，2013，41(8):20－23.

［10］薛 曉，榮 霞，葉自霞，等.膠體金免疫層析法在畜禽產品獸藥殘留檢測中的應用［J］.動物醫學進展，2013，34(12):179－182.

［11］劉 瑾，張婉潔，王 文，等.利用SPR生物傳感器檢測牛奶中的氨芐青霉素殘留［J］.化學研究與應用，2013，25(5):754－759.

［12］Haughey Simon A，Baxter G Andrew.Biosensor screening for veterinary drug residues in foodstuffs［J］.Journal of AOAC International，2006，89(3):862 －867.

［13］白 冰，趙 玲，王程程，等.生物傳感器在檢測食品品質及其質量安全中的應用［J］.食品安全質量檢測學報，2012，3(5):414－420.

［14］Fidel Toldrá，Milagro Reig.Methods for rapid detection of chemical and veterinary drug residues in animal foods［J］.Trends in food science and technology，2006，17(9):482 －489.

［15］郝貴增，龍 淼.肉類食品中獸藥殘留快速檢測研究進展［J］.肉類工業，2008，(8):54－56.

［16］Milagro Reig，Fidel Toldrá.Liquid chromatography for the rapid screening of growth promoters residues in meat［J］.Food Analytical Methods，2008，1(1):2－9.

［17］周春鳳，郭時金，梅建國，等.超高效液相色譜技術在獸藥分析領域應用的研究進展［J］.中國畜牧獸醫，2013，40(4):162－166.

［18］劉雪紅，李 娟，董紫凌，等.雞肉中磺胺類藥物殘留的薄層色譜檢測方法［J］.中國畜牧獸醫，2007，34(5):31－33.

［19］Milagro Reig，Fidel Toldrá.Veterinary drug residues in meat:concerns and rapid methods for detection［J］.Meat Science，2008，78(1):60－67.

［20］韓 立，張躍京，李華岑，等.薄層色譜技術在中獸藥分析與檢測中的應用［J］.河南畜牧獸醫(綜合版)，2009，30(7):11－12.

［21］Meng Meng，Rimo Xi.Review:current development of immunoassay for analyzing veterinary drug residue in foods and food products［J］.Analytical Letters，2011，44(15):2543 －2558.

［22］田 苗.豬組織中10種β－興奮劑類獸藥殘留量的氣相色譜－質譜法檢測［J］.分析測試學報，2010，29(7):712－716.

［23］王麗娜，陳曉輝，畢開順.GC－MS法測定豬肉中雌激素類藥物殘留量［J］.沈陽藥科大學學報，2010，27(6):466－469.

［24］李 丹，孫 雷，畢言鋒，等.超高效液相色譜－串聯質譜法檢測豬尿中20種β－受體激動劑殘留［J］.中國獸藥雜志，2013，47(12):50－56.

［25］FU Shi－jun，GUO Shi－jin，ZHANG Zhi－mei，et al.Application of liquid chromatography－tandem mass spectrometry in determination of veterinary drug residues［J］.Animal Husbandry and Feed Science，2013，5(2):101－104.

［26］王俊菊，高木珍，包建民.高效液相色譜串聯質譜技術在獸藥殘留檢測中的應用進展［J］，中國獸藥雜志，2011，45(7):46－51.

［27］高 潔，苗 虹.獸藥殘留檢測技術研究進展［J］.食品安全質量檢測學報，2013，4(1):11－18.

［28］郭黎明，朱 奎，江海洋，等.超高效液相色譜－串聯質譜法同時測定雞肝中殘留的四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物［J］.色譜，2009，27(4):412－416.

［29］晏利芝，趙永彪，富 玉，等.超高效液相色譜－串聯質譜法同時測定豬肉中β－受體激動劑、喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留量［J］.分析試驗室，2011，30(1):84－86.

［30］Renata Pereira Lopes，Rocío Cazorla Reyes，Roberto Romero －González，et al.Development and validation of a multiclass method for the determination of veterinary drug residues in chickenby ultra high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Talanta，2012，89:201 －208.

［31］曹 慧，陳小珍，朱 巖，等.同位素稀釋－固相萃取－超高效液相色譜－串聯質譜技術同時測定畜禽肉中四類獸藥殘留［J］.質譜學報，2013，34(4):202－214.

［32］郭德華，鄧曉軍，趙善貞，等.固相萃取－高效液相色譜/串聯質譜同時檢測動物源性食品中76種獸藥殘留［J］.分析化學，2010，38(3):318－324.

［33］Jia Zhan，Di－ ming Xu，Shi－ jie Wang，et al.Comprehensive screening for multi－class veterinary drug residues and other contaminants in muscle using column－switching UPLC－MS/MS［J］.Food Additives＆ Contaminants:Part A，2013，30(11):1888－1899.

［34］顏流水，溫振東，井 晶，等.豬肝中克倫特羅和沙丁胺醇的毛細管電泳－質譜聯用分析［J］.分析測試學報，2006，25(6):43－45.

［35］Blasco Cristina，Picó Yolanda，Andreu Vicente.Analytical method for simultaneous determination of pesticide and veterinary drug residues in milk by CE－MS［J］.Electrophoresis，2009，30(10):1698－707.

［36］付石軍，郭時金，闞德英，等.毛細管電泳技術在獸藥殘留分析中的應用現狀［J］.黑龍江畜牧獸醫，2013，(23):31－34.