關節軟骨組織體外保存力學環境構建

門 蒙 亓建洪

(泰山醫學院運動醫學研究所，山東 泰安 271000)

目前多種治療方法運用于關節軟骨缺損的修復，但大多數療效不理想，修復組織也以纖維軟骨為多，缺乏正常透明軟骨的生物力學性能及耐用性。 同種異體骨軟骨移植術是將供體關節的活性骨軟骨塊移植到受體關節軟骨及軟骨下骨缺損區，以修復關節軟骨損傷〔1,2〕。患者軟骨缺損區完全被透明軟骨修復；關節軟骨細胞完全包埋在周圍軟骨基質中，為“免疫豁免”組織。關節軟骨是一種特殊的結締組織，表面光滑位于骨兩端關節面位置，在骨與骨間的關節處為其活動提供低磨損和摩擦的光滑界面，起著緩沖運動震蕩，傳遞載荷等不可替代的作用。關節軟骨內無血管、淋巴管及神經組織，組織代謝活性較低，營養全部來自關節液，基本無自身修復能力〔1,2〕。異體軟骨移植材料來源充足，不需要二次手術獲取移植物而受到患者歡迎。盡管同種異體軟骨是目前治療軟骨缺損較有效的治療手段，但實際操作過程中仍存在一些問題。同種異體骨軟骨移植中重要的問題是移植物的保存。體外保持軟骨細胞正常活性，延緩細胞凋亡，促使其分泌軟骨基質，保持軟骨組織正常活性及形態。因此,延長移植物的保存時間是同種異體軟骨移植的關鍵。目前，體外培養保存活性關節軟骨組織的最長時間為3 w，遠不能滿足臨床需要。限制軟骨體外保存的主要因素：化學因素及物理因素。化學因素包括溫度、pH值、CO2、保存液成分。物理因素主要為力學環境。軟骨體外保存均為靜態液體保存，缺少物理因素干預。如何在體外構建模擬人體的力學環境，延緩體外保存軟骨細胞的凋亡率，保持軟骨細胞生物活性從而延長保存時間是研究探索的重點。

1 關節軟骨體外力學環境

成人關節骨軟骨自關節面向深部可分為透明軟骨層、鈣化軟骨層和軟骨下骨三層結構。透明軟骨主要由軟骨細胞和Ⅱ型膠原蛋白與蛋白多糖等細胞外基質(ECM)組成；鈣化軟骨層主要由少量肥大軟骨細胞和Ⅱ型膠原蛋白與羥基磷灰石等ECM組成；軟骨下骨主要由成骨細胞和Ⅰ型膠原蛋白與羥基磷灰石等ECM組成。關節骨軟骨的這種特殊結構組成及其界面連接方式，不但有利于各層組織利用各自的生理微環境進行新陳代謝，而且有利于其生物力學功能的發揮。ECM包括膠原和蛋白聚糖,其中軟骨細胞所特有分泌的膠原Ⅱ型膠原占膠原總量的九成, Ⅱ型膠原保障關節軟骨的抗張力強度,軟骨細胞活性降低導致Ⅱ型膠原分泌量下降，從而軟骨組織力學性能的減弱〔3〕。在對軟骨細胞培養過程中發現顯示動態壓力(DC)刺激可維持Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成〔4〕。軟骨細胞在人體內處于封閉力學環境中，根據模擬關節真實運動，軟骨細胞對壓應力、張力、剪切力均敏感〔5，6〕。力學載荷促使軟骨細胞的正常功能和ECM正常表達的穩定。

關節軟骨由軟骨基質及軟骨細胞組成,軟骨細胞僅占軟骨體積的1%～5%,但合成ECM,并調節基質的代謝，體外研究實驗多采用的壓力方式有兩種：DC、靜態壓力(SC)。軟骨組織塊在SC下處于壓縮狀態，導致軟骨細胞代謝能力的下降，細胞活性的衰落，抑制組織合成與代謝。目前國內外研究軟骨體外保存培養實驗中均靜態或SC，實驗過程中關節軟骨處在制動狀態，缺乏應力負荷刺激，使關節軟骨內蛋白聚糖含量下降，關節軟骨內水和電解質平衡紊亂細胞分解代謝加強，導致軟骨基質纖維化。在對大鼠模型膝關節屈曲固定制動不同時間的研究證實了持續制動會導致軟骨生物力學性能的下降，導致關節疾病的發生〔7〕。根據動物實驗發現壓縮力可以刺激軟骨細胞的分化與代謝。而在對壓縮力性質試驗中發現動態壓力刺激的效果更明顯〔8～10〕。關節軟骨日常活動時產生的即是動態壓縮力，與關節日常功能一致，是軟骨在體內受到的主要作用力〔11〕。DC的其他作用主要有以下幾個：①可維持細胞正常的滲透壓，減少細胞膜滲透性；②可在早期干預關節炎的發生發展；③有助于軟骨細胞保持正常形態；④有利于超微結構的恢復；同時在細胞新陳代謝中的作用無可比擬〔12〕。

膝關節在股骨遠端與脛骨近端起到支撐、運動的作用,關節囊內有滑液,起到營養軟骨和潤滑軟骨表面。股骨髁、半月板、脛骨平臺相互接觸,產生相對運動,一種是滾動,另一種是滑動〔13〕，一種可以想象成搟面杖壓面皮，一種為汽車車輪的滑動，由此兩種合力產生的對關節軟骨的表面剪切力。孫明林等〔14〕進一步研究了在不同壓縮強度下獲得的組織工程軟骨性能，發現在0.4 Hz、20%壓縮強度、3 h滾壓時間的滾壓參數下，干細胞能更好地向軟骨細胞分化以及維持軟骨細胞表型。人正常行走膝關節運動是由滾動和滑動共同構成的,滾動約占60%,滑動約占40%;滾動速度為0～15 cm/s,滑動速度為0～35 cm/s〔15〕。

2 生物反應器

生物反應器的目的是為體外培養構建提供合適的生物環境,通過組織工程培養獲得與人體組織相似的結構與功能〔16〕，化學條件溫度以及CO2的控制可在細胞孵化箱內調節，pH值的控制也可調節，對于物理因素的調節仍在探索中。用于軟骨培養的生物反應器種類較多，由于目前沒有一個確定的結論，所以各反應器施加的力不盡相同：流體剪應力、液體壓力、拉伸、直接壓縮、變形剪應力或其中力的組合〔17〕。目前仍沒有一種較為理想的生物反應器。生物反應器及生物體外保存裝置的要求：裝置充分模擬人體生物環境，使營養物質與代謝產物有效循環利用，使得裝置中的pH值、液體濃度、CO2含量等維持穩定；能保證培養物內部信號分子、營養和廢物的有效運輸，能施加有效力學刺激彌補體外培養的不足，但要保證施加力學刺激不會對細胞產生破壞及損傷，盡最大可能模仿體內真實力學刺激環境。從功能上來看，組織工程反應器與軟骨體外培養生物反應器基本一致，都是提供與人體相似的生物環境與力學環境。軟骨保存反應器的力學環境是為了抑制細胞凋亡，將細胞生存率保持在一個較高水平。目前國內外多為組織工程生物反應器的研究探索，實驗對象均為軟骨細胞或干細胞誘導軟骨細胞，尚沒有完整的針對軟骨組織塊的生物反應器。在對體外軟骨組織塊力學保存上沒有一個完善的標準，存在較多爭議，原因是多方面的：由于個體的差異及軟骨所處內環境的復雜性，難以有一個統一的生物學標準;物理因素對體外培養產生的影響未引起足夠認識，在生物反應器中其生物和物理參數根據環境的不同而改變，隨著臨床需要的加大，組織工程研究的深入、機械控制技術以及生物材料應用的提高，可實現對生物反應器生物環境的精確控制，選擇最佳生物參數，建立體外培養即時控制反饋系統〔18〕。在保存液技術較為成熟的情況下，軟骨體外保存反應器將成為軟骨體外保存的研究趨勢。

3 總結與展望

同種異體軟骨移植技術經臨床實驗及長期跟蹤隨訪被證實為有效的治療關節損傷疾病的方法。隨著保存液技術的不斷發展，軟骨的保存時間得到有效延長。從軟骨培養的生物反應器的發展看,軟骨細胞對很多物理因素都有響應,而力學因素的影響占重要位置。軟骨的體外培養中,若能施加力學刺激能提高軟骨細胞的成活率。要探索得到合適的力學條件,按照組織工程仿生的原理,還需研究關節的自然運動。

4 參考文獻

1衛小春.關節軟骨〔M〕.北京:科學出版社,2007:1-83.

2Bae JY, Matsumura K, Wakitani S,etal.Beneficial storage effects of epigallocatechin-3-o-gallate on the articular cartilage of rabbit osteochondral allografts〔J〕.Cell Transplant,2009;18(5):505-12.

3Malinin T,Temple HT,Buck BE.Transplantation of osteochondral allografts after cold storage〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2006;88(4):762-70.

4Wright MO,Nishida K, Bavington C,etal.Hyperpolarisation of cultured human Chondroeytes following cyclieal pressure-induced strain:evidence of a role for Alpha 5 beta 1 integrin as a chondrocyte mechanoreceptor〔J〕.Orthop Res,1997:15(5):742-7.

5顧 延,戴克戎,裘世靜,等.應力降低導致關節軟骨退變機理的形態學研究〔J〕.中華骨科雜志,1995;15(9):631-3.

6Shiu YT,Li S,Yuan S,etal.Shear stress-induced-fos activation is mediated By rho in a calcium-dependent manner〔J〕.Biochem Biophys Res Comm,2003;303(2):548-55.

7Hagiwara Y,Ando A,Chimoto E.Changes of articular cartilage after immobilization in a rat knee contracture model〔J〕.J Orthop Res，2009;27(2):236-42.

8Haugh MG, Meyer EG, Thorpe SD.Temporal and spatial changes in cartilage-matrix speciic gene expression in mesenchymal stem cells in response to dynamic compression〔J〕.Tissue Eng Part A,2011;17(23-24):3085-93.

9Sch?tti O,Grad S,Goldhahn J.A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells〔J〕.Eur Cell Mater,2011;22:214-25.

10沈士浩，李雪萍.應力負荷與關節軟骨損傷〔J〕.中國康復醫學雜志，2013；28(5)：475-8.

11亓建洪,王 偉,吳雅迪,等.人異體骨軟骨移植物保存方法研究〔J〕.中國矯形外科雜志,2012;20(1):64-7.

12Jackson DW, Whelan J, Simon TM.Cell survival after transplantation of fresh meniscal allografts.DNA probe analysis in a goat model〔J〕.Am J Sports Med,1993;21 (4):540-50.

13陳啟明,梁國穗,秦 嶺,等.骨科基礎科學-骨關節肌肉系統生物學和生物力學〔M〕.北京：人民衛生出版社,2003：420-80.

14孫明林,朱 雷,呂 丹,等.不同參數滾壓模式對兔BMSCs向軟骨細胞分化促進作用的研究〔J〕.中國修復重建外科雜志,2013;27(1):89-94.

15Guilak F,Butler DL, Goldstein SA,etal.Functional tissue engineering〔M〕.Berlin:Springer-Verlag,2004:332-400.

16樊瑜波，陶祖萊.組織工程生物反應器的生物力學 〔J〕.醫用生物力學,2005;20(4):203.

17張春秋，孫明林，李 江，等.節軟骨體外構建力學環境的研究進展 〔J〕.醫用生物力學,2009;24(6)：462-7.

18王 華.剪切力對體外培養人軟骨細胞代謝的影響〔D〕.武漢：武漢大學,2011.