MicroRNAs在支氣管哮喘中的研究進展①

卞勇華 崔玉寶(鹽城衛生職業技術學院醫學檢驗學院，鹽城 224005)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的，以氣道炎癥、氣道高反應性(Airway hyper responsiveness，AHR)、可逆性氣道阻塞為特征的氣道慢性炎癥性疾病。據估計全球約有3億哮喘患者，每年有25萬人死于哮喘病［1］。氣道炎癥是哮喘最主要的病理變化，以肥大細胞、中性粒細胞、Th2細胞及嗜酸性粒細胞的浸潤為主要特征，并決定氣道阻塞和AHR的程度。Th2細胞分泌的細胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)與氣道炎癥密切相關，并可以促進IgE的產生、嗜酸性粒細胞的增殖和分化、黏液的分泌，誘導氣道高反應性和氣道重塑［2，3］。氣道重塑被認為是哮喘難治的根本原因，近年來受到了研究者的高度重視，但是目前尚缺乏有效的防治措施。

目前對于哮喘主要是應用糖皮質激素(如地塞米松)和β-2受體激動劑(如沙丁胺醇、沙美特羅等)進行治療。雖然這些藥物通過控制氣道炎癥和舒張氣道平滑肌(Airway smooth muscle，ASM)極大改善了哮喘患者的癥狀，但是副作用明顯，如發音困難、鵝口瘡和心律失常等［4］。此外，還有相當一部分哮喘患者對糖皮質激素并不敏感。因此，急需尋找一種新的、有效的、副作用少的方法來治療哮喘。

MicroRNAs(miRNAs)是一種長度約為22個核苷酸(nucleotide，nt)的內源性非編碼單鏈小分子RNA，通過對靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，負調控靶基因的表達。miRNAs在癌癥、病毒感染、肺部炎癥性疾病均發揮了重要的功能［6-8］。本文就近年來miRNAs在哮喘發病中的作用及潛在的應用前景作一綜述。

1miRNAs概述

隨著1993年第一個miRNA(lin-4)在線蟲中被發現，越來越多的miRNAs在不同物種被發現，截止到2013年6月miRBase 20(www.mirbase.org)顯示:已注冊miRNAs含有發夾結構 miRNAs前體序列24 521個，成熟miRNAs序列30 424個。大量研究表明，miRNAs廣泛參與細胞增殖、分化及凋亡、應激反應、免疫反應等多種生物活動過程［9，11］。miRNAs由大小為60～75個 nt具有莖環結構的miRNAs前體(pre-miRNAs)剪切生成，成熟的miRNAs在細胞質中與RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結合，形成miRNAs沉默復合體。miRNAs沉默復合體通過miRNAs 5'端6～8個 nt的種子序列互補結合靶mRNA的3'端的非翻譯區(3'-untranslated region，3'-UTR)阻斷核糖體讀取mRNA或者直接降解mRNA，調控靶 mRNA 的表達［5］。

miRNAs代表一類新的藥物靶標，可以通過反義抑制或過表達miRNAs治療相應疾病［12］。反義抑制miRNAs方法包括使用2'-OMe或鎖核苷酸(Locked nucleic acid，LNA)修飾的反義寡聚核苷酸(Anti-miRs)和膽固醇分子偶聯的寡聚核苷酸(Antago-miRs) 結合miRNAs使其失活［13，14］。miRNAs表達下調所引起的疾病可以使用miRNA類似物或成熟的miRNAs進行替代治療。表達短發夾RNAs的質粒或病毒載體可用于miRNAs的過表達和穩定表達，因為這種方法可以方便地通過一個轉錄物表達多個 miRNAs［15］。通過這些方法調節miRNAs功能為哮喘的治療提供一種新的思路。

2miRNAs與哮喘

雖然目前對于miRNAs與哮喘關系的研究相對較少，但現有研究表明miRNAs與哮喘的疾病進程密切相關。例如，Garbacki等［16］對急性、亞急性和慢性小鼠哮喘模型的肺組織miRNAs表達譜分析發現8個可能與哮喘相關的候選miRNAs。Tsitsiou等［17］對哮喘患者miRNAs表達譜分析證實，重度哮喘患者 CD8+和CD4+T細胞中miR-28-5p和 miR-146a/b表達選擇性下調與mRNA表達的廣泛變化相關。

2.1 miRNAs與細胞因子及炎癥

2.1.1 miR-126 通過對小鼠哮喘模型的研究，Mattes等［18］報道塵螨(House dust mite，HDM)誘導的小鼠急性哮喘模型氣道中miR-126的表達顯著上調，而通過antago-miR-126抑制其表達可緩解哮喘特征性反應如氣道炎癥和氣道高反應性、Th2型細胞因子(如IL-5和 IL-13)分泌、氣道嗜酸性粒細胞浸潤和黏液分泌。miR-126的表達上調依賴于TLR4/MyD88信號通路，因為HDM誘導的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)或髓樣分化因子88(Myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)缺陷小鼠均未出現miR-126的表達上調，并且AHR降低和氣道嗜酸性粒細胞浸潤減少。然而，Collison等［19］發現在卵白蛋白(Ovalbumin ，OVA)誘導的小鼠慢性哮喘模型中miR-126在誘導的最初2周表達上調，6周后下降至基線水平附近。通過antago-miR-126抑制miR-126的表達，只能減少小鼠慢性哮喘模型氣道嗜酸性粒細胞浸潤，而對氣道慢性炎癥和氣道重塑不產生影響，提示可能有多種miRNAs參與了哮喘發生的調控。

2.1.2 Let-7 Let-7家族是miRNAs中研究最為深入的家族之一，其家族成員在不同的物種高度保守。人類let-7家族有11個成員(let-7a-g、let-7i-k、mir-202)，其中 let-7j和 let-7k 在小鼠是不表達的［20］。IL-13與哮喘的發病密切相關，可引起氣道反應性增高、嗜酸粒細胞浸潤和黏液分泌增多［21］。Polikepahad等［22］通過熒光素酶報告系統證實IL-13是let-7a的直接作用靶點，進一步研究發現反義抑制let-7a可提高小鼠CD4+T細胞中IL-13 mRNA的表達水平，推測let-7a可能是哮喘的抗炎因子。然而體內實驗證實，抑制OVA誘導的小鼠哮喘模型中let-7a-d表達可減少哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(Broncho alveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細胞浸潤，降低Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)表達水平，提示let-7在哮喘發生過程中具有促炎作用［22］。但是，Kumar等［23］研究結果卻與此相反，他們的研究證實let-7哮喘發生過程中具有抗炎作用，可直接抑制IL-13的表達，并且在OVA誘導的小鼠哮喘模型肺組織中let-7家族成員(let-7a-d、let-7f-g、let-7i)表達下調。鼻腔給予let-7類似物，可以緩解OVA誘導的小鼠哮喘模型氣道炎癥、降低AHR、減少氣道黏液分泌和纖維化。因此，Let-7在哮喘發生過程中的功能還需要進一步研究證實。

2.1.3 miR-21 Lu等［24］第一次證實 miR-21在哮喘發生過程中具有重要功能，在OVA、煙曲霉菌、IL-13轉基因誘導的小鼠哮喘模型中均觀察到miR-21表達上調。進一步研究發現miR-21通過調控靶基因 IL-12p35抑制IL-12的表達。IL-12對維持Th1/Th2平衡起重要作用［25］，IL-12的表達降低部分解釋了哮喘過高的Th2免疫應答。Lu等［26］通過miR-21-/-基因敲除小鼠進一步研究 miR-21的功能，發現OVA誘導的 miR-21-/-基因敲除小鼠哮喘模型肺部嗜酸性粒細胞的浸潤較少，BALF中IFNγ和IL-12表達水平升高，IL-4的表達水平顯著降低。這些結果表明miR-21對Th1/Th2的平衡調節起重要作用。此外，也有研究報道miR-21可負反饋調控程序性細胞死亡因子4(Programmed cell death 4，PDCD4)的表達從而發揮抗炎作用［27］。miR-21的這種雙重作用表明miRNAs調控的復雜性，這兩項研究表明miR-21是重要的免疫調節分子。

2.1.4 miR-155 miR-155已經被證實在Th1/Th2分化過程中起關鍵作用。Banerjee等［28］研究發現過表達miR-155可促使CD4+T細胞分化為Th1細胞，而抑制miR-155的表達可促使CD4+T細胞分化為Th2細胞。Martinez-Nunez等［29］報道 miR-155可通過調控IL-13通路影響巨噬細胞的表型，從而使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。Th1/Th2細胞之間的比例和功能失衡是哮喘的主要發病機制之一，這些研究結果表明miR-155與哮喘的發生密切相關。Zhang等［30］在哮喘患者外周血CD4+T細胞中觀察到miR-155的表達下調，其表達水平與哮喘嚴重程度相關，提示miR-155在哮喘發生過程中具有重要作用。因此，增加miR-155的表達可能是減緩哮喘發病和治療的一條新途徑。

2.1.5 miR-145 雖然對哮喘發生過程中miR-145的作用研究還不充分，但 Collison等［31］發現其在HDM誘導的哮喘小鼠模型氣道壁中表達上調。Collison等［31］進一步研究發現在第一次HDM誘導前鼻內給予anti-miR-145，可明顯減少氣道黏液分泌、嗜酸性粒細胞浸潤，降低氣道高反應性和Th2型細胞因子(IL-5、IL-13)的表達水平，與地塞米松的抗炎作用相當。而在最后一次HDM誘導前鼻內給予anti-miR-145，只能減少氣道黏液分泌和降低氣道高反應性，對嗜酸性粒細胞浸潤不起作用。這些結果表明miR-145在哮喘發生過程中具有促炎作用，其具體作用機制還有待深入研究闡明。

2.1.6 miR-146 miR-146家族包括miR-146a和miR-146b，哮喘患者 miR-146a和 miR-146b表達水平的改變已經被報道。Tsitsiou等［17］發現重度哮喘患者體內 CD4+和 CD8+T細胞 miR-146a和 miR-146b的表達下調。miR-146a的表達下調可能與重度哮喘的發生有關，因為有報道證實在急性和慢性炎癥發生過程中miR-146a敲除的T細胞活性增強［32］。但是，也有研究報道在OVA誘導的小鼠哮喘模型中脾CD4+T細胞miR-146a和miR-146b的表達上調，是哮喘的促炎因子［33］，所以，miR-146a和miR-146b在哮喘發生過程中的作用還需要進一步研究。

2.1.7 miR-106a miR-106a已經被證實可以通過轉錄后調控抑制IL-10的表達［34］。IL-10是目前已知具有抗炎作用的細胞因子，研究表明利用攜帶IL-10基因的重組腺病毒治療OVA誘導的小鼠哮喘模型，可明顯減輕哮喘小鼠的AHR和氣道炎癥［35］。Sharma等［36］報道在OVA誘導的小鼠哮喘模型肺部miR-106a的表達顯著上調，而IL-10的表達顯著下調。利用 anti-miR-106a抑制小鼠哮喘模型肺部miR-106a的表達，發現哮喘小鼠肺組織中IL-10的表達增加，AHR和氣道炎癥明顯緩解，Th2免疫應答、杯狀細胞化生以及氣道纖維化明顯減少。作者聲稱，這項工作是第一次在體內證明了miRNAs對IL-10表達的調控作用，為預防哮喘發生提供了一個新的思路。

2.1.8 miR-221 Mayoral等［37］報道 miR-221 對活化的肥大細胞具有特異性作用，可以調節肥大細胞的脫顆粒、細胞因子釋放、遷移和黏附。肥大細胞是參與Ⅰ型超敏反應的主要效應細胞，提示miR-221可能與Ⅰ型超敏反應疾病(如哮喘、過敏性鼻炎)的發生密切相關。Liu等［38］發現miR-221可能在哮喘發生過程中具有重要的功能，通過miRNAs微陣列分析和定量PCR發現兒童哮喘患者及OVA誘導的小鼠哮喘模型中miRNA-221和miRNA-485-3p的表達上調。Qin等［39］證實在OVA誘導的小鼠哮喘模型中miR-221表達上調，抑制miR-221的表達可減輕小鼠哮喘模型的氣道炎癥。

2.2 miRNAs與氣道平滑肌

2.2.1 miR-133a與高反應性 Chiba等［40］第一次提出miR-133a可能在哮喘中具有重要功能的假說。假說源于miR-133a對心臟肌肉收縮影響的一項研究，推測 miR-133a對于支氣管平滑肌(Bronchial smooth muscle，BSM)可能有類似的作用。實驗證實miR-133a可負反饋調節 ASM細胞中 RhoA(Ras homolog gene family member A)的表達，在IL-13刺激人BSM細胞和OVA誘導的小鼠哮喘模型中miR-133a表達下調，RhoA表達上調。RhoA是BSM收縮的一個關鍵蛋白，其表達上調可促進BSM的收縮，增強 ASM 高反應性［41］。Kume 等［42］研究表明RhoA/Rho激酶信號通路可能是治療哮喘患者氣道高反應性的新靶點，通過上調BSM細胞中miR-133a的表達水平抑制RhoA/Rho激酶信號通路可能會緩解哮喘患者氣道的高反應性，當然這需要進行深入研究。

2.2.2 miR-25與表型改變 雖然平滑肌的高反應性是研究熱點，但平滑肌表型的改變也促進了平滑肌高反應性和炎癥介質的產生。Kuhn等［43］研究了miRNAs在ASM表型改變中的作用。他們利用IL-1β、TNF-α 和 IFN-γ 混合物模擬炎癥刺激，通過miRNAs微陣列分析和定量PCR發現在炎癥刺激的ASM細胞中miR-25表達顯著下調。利用生物信息學方法預測靶基因及實驗證實miR-25可以通過調節炎癥介質(RANTES，嗜酸粒細胞趨化因子等)和調控細胞外基質轉化相關基因及肌球蛋白重鏈等收縮蛋白的表達，共同影響ASM表型。但是，miR-25是通過對哪些靶基因轉錄后調控來影響ASM表型，還有待進一步研究闡明。

2.3 miRNAs與哮喘遺傳因素 HLA-G(Human leukocyte antigen，HLA)是已經被證實的哮喘易感基因［44］，屬于HLAⅠ類基因，其編碼的HLA-G分子主要存在于母胎界面，有助于母胎免疫耐受的產生。Tan等［45］研究發現 HLA-G的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與哮喘易感性相關，并且可以影響miRNAs對HLA-G的調控。HLA-G SNP位點(+3142C/G)位于miR-152家族(miR-148a、miR-148b、miR-152)與 HLA-G 結合的靶點。HLA-G+3142G/G基因型與miR-152家族的結合較+3142C/C基因型結合穩定，提示SNP位點(+3142C/G)有可能是通過干擾miR-152家族與HLA-G的結合，從而影響miR-152家族對HLA-G的調控。Nicodemus-Johnson等［46］研究發現母親是否患有哮喘將影響哮喘患者miR-148b和可溶性HLAG分子(sHLA-G)的表達。母親患有哮喘的患者氣道上皮細胞中miR-148b的表達顯著下調，BALF中sHLA-G分子濃度與SNP位點(+3142C/G)基因型密切相關。這提示miR-152家族對HLA-G的調控不僅與哮喘患者的HLA-G基因型有關，而且還與其母親是否患有哮喘相關。

Su 等［47］進行了pre-miRNAs的SNPs研究，在其前期工作基礎上選擇了4個SNPs位點(rs11614913、rs3746444、rs2910164、rs2292832)，其中rs2910164位點C等位基因和rs2292832位點T等位基因的出現可降低中國人患哮喘的風險。Jimenez-Morales等［48］也發現了類似的結果，墨西哥女性哮喘患者rs2910164位點C等位基因的出現伴隨著哮喘發病風險的降低。rs2910164位點存在于miR-146a的pre-miRNAs的莖環結構中，其多態性可能影響 pre-miR-146a加工或者 miR-146a的功能［49］。而miR-146a可通過調節白介素1受體相關激酶 1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor，TRAF6)表達負反饋調節TLR4通路，在哮喘氣道炎癥及氣道重塑過程中具有重要的作用［50］。

3 結語

雖然miRNAs在哮喘發病機制中的研究仍處于起步階段，但是一些miRNAs已經被證實對哮喘的發病起促進或抑制作用，有可能作為未來哮喘治療的靶點。基于Let-7和miR-146類似物的藥物有可能顯著糾正哮喘患者肺部IL-13的過表達及其他促炎細胞因子的表達，而基于miR-133a類似物的藥物可能修復ASM細胞的高反應性。相反，利用antimiRs抑制 miRNAs(miR-21、miR-106a、miR-126、miR-145、miR-155、miR-221)的表達，有可能控制哮喘患者肺部細胞因子的異常表達和炎癥的發生。選擇有效和特異性的miRNAs/anti-miRs，令其有效地進入呼吸道及到達預定位置后緩慢釋放都是基于miRNAs哮喘藥物的進一步研究方向。

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