GPC3在癌癥免疫治療及診斷中的意義①

易達委 孫 斌 劉曉霓 陳德喜 王延軍

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京市肝病研究所，北京 100069)

肝細胞癌(HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國每年約11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數的45%。免疫治療因其靶向性好，副作用少而廣受關注，而鑒定一個有效的分子靶點則是腫瘤免疫治療的關鍵。在此，我們將討論磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的結構、功能和生物學特點，并將其作為癌癥免疫療法中藥物作用靶點的潛能為討論重點，研究其在人類癌癥治療中的作用。

GPC3是一種在HCC以及黑色素瘤等多種癌癥中高度表達的膜蛋白，其基因編碼的70 kD核心蛋白被前蛋白轉換酶Furin酶切后，產生40 kD的氨基端亞單位和30 kD具有兩條硫酸乙酰肝素(HS)鏈的羧基端亞單位。GPC3蛋白通過糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI)錨定在細胞膜上(如圖1所示)。羧基末端的膜結合蛋白可以被單克隆抗體(mAb)1G12識別。GPC3與Wnt及Hedgehog(HH)信號蛋白相關［1］。GPC3可以與Wnt信號分子形成一個復合體，并通過刺激Wnt信號促進肝癌生長。GPC3的突變將導致GPI錨定域的缺失，阻斷Wnt信號通路，從而抑制依賴于Wnt信號的腫瘤生長。在人HEK-293細胞中制造出缺少 GPI錨定域的重組sGPC3蛋白，發現其能夠抑制HCC的生長［2］，但不能排除是由于其他因素造成。實驗中也發現，GPC3可通過與HH信號通路的相互作用，調節生長發育［1，3］。此外，GPC3 的 HS 鏈可以與 FGF-2 成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)相互作用，并調節生長因子的活性，在肝癌細胞中也發現了GPC3與FGF-2的相互作用現象［4］。

1 GPC3在人類惡性腫瘤中的表達

HCC和CCA是原發性肝癌的兩種主要形式，越來越多的證據支持GPC3可作為肝細胞癌的一種新的腫瘤標志物。GPC3在肝癌組織中高表達，而膽管細胞癌及正常的肝組織中則不表達。GPC3在HepG2和 Hep3B 細胞，HT17、HuH6、Huh7和 PLC/PRF/5等HCC細胞株中均高度表達。利用單克隆抗體1G12檢測或免疫組織化學方法檢測［5，6］，可以在70%以上的肝細胞癌中發現GPC3，其余非肝細胞癌病例均為陰性，包括膽管癌、肝轉移癌、肝細胞癌癌旁肝組織(包括肝硬化和血管瘤旁肝組織)。

圖1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的結構示意圖Fig.1 Schematic of the GPC3 protein.

由于發現GPC3陽性患者的5年生存率較GPC3陰性患者低(54.5%vs 87.7%，P=0.031)，具有顯著統計學差異，證明GPC3的表達與肝細胞癌的預后不良情況密切相關［7］。在肝移植的患者中，血管侵犯與GPC3的表達顯著相關，而沒有GPC3表達的患者無復發生存期顯著延長(P＜0.05)，表明GPC3 mRNA的過度表達可能是肝移植術后的不良指標。

GPC3也在黑色素瘤、卵巢透明細胞癌、卵黃囊瘤(YST)、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、腎母細胞瘤細胞、睪丸非精原細胞瘤、脂肪肉瘤以及胃癌的特殊群體GPC3-GC中，也具有較低程度的表達。然而，目前GPC3在除HCC以外的其他人類腫瘤中診斷意義仍不明確。

2 GPC3與HCC診斷與預后檢測

GPC3在HCC組織中高度表達，且檢測陽性的患者，其血液中也可以檢測到少量的GPC3［5］，因而血液中的GPC3含量將可能作為一種有效的診斷依據，并以此監測這些患者的病情發展。Filmus及其同事開發出了能與GPC3羧基端特異性結合的單克隆抗體1G12［5］。在泰國最近完成的一項研究中，利用單克隆抗體1G12檢測，發現有53%HCC患者的血清中呈現明顯的GPC3陽性，但在健康的血清提供者及肝炎患者的血清中則檢測不到［8］。此外，GPC3還是HCC患者根治性切除后，用于預測腫瘤復發和總生存期的一種潛在的、可靠的生物標志物，高GPC3的表達是癌癥復發的危險信號，而低表達的患者預后一般較好［9］。

AFP作為肝癌腫瘤標志物，受其敏感性和特異性限制，單獨檢測難以區別不同肝癌。而GPC3在HCC組織中高度表達，且在AFP陰性患者中也有很高檢測率，其mRNA的陽性表達率高達70%［8］。研究顯示，GPC3作為血清標志物與AFP聯合檢測診斷肝癌，可以提高診斷的敏感性［10］。

區分肝細胞癌與膽管細胞癌，尤其是肝內膽管細胞癌(ICC)，是一個至關重要的問題。GPC3在肝細胞癌中高度表達，而在肝內膽管細胞癌及膽囊癌中檢測不到［11］。因此，這些研究表明GPC3具有作為原發性肝癌，尤其是肝細胞癌的診斷潛力［8，12］。如圖2所示，大部分在肝細胞癌中表達的GPC3都表現出細胞質分布。相關研究表明，幾乎一半的HCC病例表現出混合分布(細胞質和細胞膜)，而另一半僅表現為細胞質分布［7］。最近的一項研究利用HepG2的移植組織，完成了對GPC3免疫組化的組織處理方法的優化［13］。進一步的研究需要闡明是否不同分布的GPC3具有不同的功能意義和診斷價值。

3 以GPC3為靶點的免疫療法

考慮到在肝癌，黑色素瘤和卵巢透明細胞癌的高度表達，GPC3被認為可作為潛在的靶點用于腫瘤免疫治療。其對于抗GPC3抗體以及細胞基礎的免疫療法的有效性已經得到開發和探索［14］。

3.1 HCC的抗GPC3抗體療法 抗GPC3抗體作為HCC免疫治療的潛能日漸得到重視，許多特異性結合GPC3的單克隆抗體也相繼被發現，包括1G12、M18D04、M19B11、A1836A 和 GPC3-C02 等。近年發現的人重鏈可變區抗體HN3與GPC3有較高親和力，且對GPC3陽性細胞的增殖表現出明顯的抑制作用［15］。另一高親和力的單克隆抗體Yp7在裸鼠體內對肝癌移植瘤表現出了明顯的生長抑制作用［16］。這些抗體在GPC3陽性HCC的免疫治療方面表現出顯著潛能。

第一個用于治療的抗GPC3單克隆抗體GC33(IgG2a，κ)，其抗原表位位于羧基末端［14，17］。這一抗體在皮下異位移植 HepG2 和HuH-7移植瘤的小鼠中，誘導產生了抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)，并展現出抑制腫瘤生長的作用。GC33誘導的ADCC抗腫瘤活性主要是由自然殺傷細胞產生［14］。GC33同樣能夠減少在肝內原位移植HepG2細胞的小鼠血液中甲胎蛋白的含量。通過CDR移植法制造出的人源GC33(hGC33)與GC33一樣對HepG2的移植有作用［18］。另一方面，相關研究發現了GPC3的膜表達與腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)相關［19，20］。在這些證據的基礎上，Takai等觀察到在使用GC33的抗GPC3免疫治療模型中，存在TAM侵入，表明巨噬細胞可能在GC33抗體的腫瘤活性中起到重要作用，而抗腫瘤活性可能通過調節GPC3功能，而不是ADCC機制發揮效應。此外，GC33不能直接抑制GPC3陽性腫瘤細胞的增殖。曾有人提出，抗GPC3抗體可能會增加肝細胞癌對化療藥物的敏感性。最近hGC33與標準化療劑相結合的抗腫瘤活性已受重視。在HepG2的移植瘤模型中，hGC33和索拉非尼相結合時比單獨使用索拉非尼更能有效地抑制腫瘤的生長。這種組合方案可能作為一種肝癌的治療方式，具有很高的臨床應用價值。

圖2 GPC3在人原發性肝癌中的表達Fig.2 GPC3 expression in human primary liver cancer

基于這些結果，以HCC晚期治療為對象的Ⅰ期臨床試驗已進行評估。該研究表明，患者對GC33耐受性良好，且副作用與劑量相關，每周安全的靜脈給藥量為20 mg左右［22］。目前Ⅱ期臨床試驗正在招募之中:www.clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT01507168。

3.2 GPC3合成肽疫苗 在皮下異位移植腫瘤的小鼠身上，由于轉入了鼠GPC3基因的Colon26細胞系，其轉錄的GPC3肽段或GPC3特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)可通過樹突狀細胞引起小鼠的保護作用［23］。這項工作表明GPC3在小鼠中具有高度的免疫原性，可以誘導有效的抗腫瘤免疫反應，并不產生自身免疫性疾病。但有數據顯示，CD8+T細胞定向性癌癥疫苗在HCC的治療中，療效有限(除非能夠鑒定出應答產生的最佳共刺激信號)，而CD4+T細胞定向性癌癥疫苗則值得開發利用［24］。

在HLA-A2.1轉基因小鼠中，GPC3疫苗可以誘導產生肽反應性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，并且不產生自身免疫反應［25］。此外，接種這些CTL的NOD/SCID小鼠其肝癌移植瘤的生長受到顯著抑制。在這些結果的基礎上進行了Ⅰ期臨床試驗，發現接種疫苗的耐受性良好，且在33例中有30例患者產生了可檢測的免疫應答反應，且免疫應答的水平與總生存期之間有一定相關性［26］。目前正在進行Ⅱ期臨床試驗，并計劃將GPC3合成肽疫苗與化療相結合［26］。

3.3 GPC3功能阻斷 除上述的免疫治療方法外，還有相關研究試圖通過阻斷GPC3的功能來達到治療目的［27］。最近發現，突變型GPC3由于缺少GPI不能附著于細胞膜，以致被排出到細胞外液而減少膜上的Wnt信號，并減少其與G蛋白偶聯受體的結合。此外，還發現異位的突變型GPC3能夠抑制幾種肝癌細胞株在體內外的生長。除了抑制Wnt信號之外，在某些細胞株中由于GPC3的外排，導致其通過HS鏈結合的生長因子也被從細胞膜上清除［27］。另一項研究表明，用重組蛋白處理HCC細胞能夠抑制突變型GPC3的功能和活性［2］。

4 結論

由于GPC3在肝細胞癌中的高度表達，目前其被認為可作為HCC抗體和細胞療法的靶點。將來工作的方向可能是研制出新一代的GPC3單克隆抗體，這種單抗能夠靶向于包括HS鏈等在內的多種功能域，與GPC3相結合;并在實驗中檢驗抗GPC3單克隆抗體能否通過阻斷Wnt信號和/或其他信號途徑中的配體與受體的相互作用，來直接抑制腫瘤生長。此外，最新的研究表明，血清型GPC3可能具有腫瘤標志物價值，能夠在腫瘤診斷和表達GPC3的惡性腫瘤患者的后續觀察中發揮作用。然而，血清GPC3的生化性質仍然在研究之中。而對于GPC3的三維結構和GPC3從癌細胞脫落的分子機制將很有研究價值。此外，免疫組化的研究表明，GPC3還具有腫瘤診斷的病理學價值。通過各種高危人群的大量病例，對GPC3本身或GPC3與其他腫瘤蛋白相組合的進一步研究，能夠驗證使用GPC3作為HCC以及其他表達GPC3腫瘤的診斷標志物的重要價值。

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