厭氧菌在腫瘤生物治療中的研究進展

黃筱鈞 鄧昭敏 張 碩 李明遠

(湖北民族學院醫(yī)學院，湖北 恩施 445000)

國際癌癥研究機構公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約800萬人死于癌癥，癌癥已成為世界嚴重的公共衛(wèi)生問題。我國每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬例，其中50歲以上人群惡性腫瘤發(fā)病率占全部發(fā)病的80%以上，80歲達到高峰，居民因癌癥死亡率是13%〔1〕。腫瘤嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，威脅著老年人的健康。傳統(tǒng)的腫瘤治療面臨著特異性不高、靶向性不強、難以對實體腫瘤的乏氧區(qū)發(fā)揮作用等方面的挑戰(zhàn)，迫切需要新療法。1813年，Vautier觀察到腫瘤患者感染氣性壞疽后，患者體內(nèi)的腫瘤生長減緩甚至消退，這一現(xiàn)象引起了人們對細菌抗腫瘤的關注。Coley等〔2〕做出了積極的探索，卡介苗(BCG)已成功用于臨床治療淺表性膀胱癌。隨著對厭氧菌的腫瘤特異性靶向定植認識的深入和生物技術的發(fā)展，利用厭氧菌治療腫瘤顯示出廣闊的應用前景。

1 厭氧菌抗腫瘤的基礎

腫瘤組織內(nèi)部特殊病理生理特點和厭氧菌自身的生物學特性是厭氧菌抗腫瘤應用研究的基礎：①腫瘤細胞生長快，而瘤內(nèi)血管形態(tài)不規(guī)則、分支紊亂，實體腫瘤內(nèi)部形成乏氧微環(huán)境，有利于厭氧菌靶向定植于腫瘤組織；②腫瘤組織代謝旺盛，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，可供厭氧菌利用，厭氧菌在瘤內(nèi)比正常組織具備更強的增殖能力，更易在腫瘤內(nèi)富集；③腫瘤內(nèi)異常血管化和腫瘤組織間隙的高壓使瘤內(nèi)免疫細胞、抗體、補體等數(shù)量減少且功能受到抑制，厭氧菌在瘤內(nèi)較難被免疫系統(tǒng)識別、清除；④某些厭氧菌為益生菌或無致病性，致病性厭氧菌所致的繼發(fā)性感染可通過抗生素得到較好控制；⑤厭氧菌基因容量較大，可進行基因修飾，具備穩(wěn)定表達外源基因的能力，是良好的基因載體；⑥厭氧菌的安全性較高，便于保存，無潛在的長期副作用。

2 厭氧菌在腫瘤治療中的研究

過去十多年，梭狀芽孢桿菌屬、沙門菌屬、雙歧桿菌屬作為基因載體和靶向抗腫瘤研究最多〔3〕。厭氧菌在治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌等方面顯示出較好的效果。Dang等〔4〕從26株細菌中篩選出具有高度腫瘤靶向定植能力的野生型諾氏梭菌(Clostridium.novyi,C.novyi)，采用熱休克法去除其毒性基因，得到無毒諾氏梭菌(C.novyi-NT)，聯(lián)合Dolastatin-10、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿等常規(guī)化療藥物治療小鼠皮下移植瘤HCT116、結腸癌和B16黑色素瘤，用藥24 h后腫瘤內(nèi)出現(xiàn)出血性壞死，顯著延長了藥物的治療時間和實驗鼠的生存周期，87.5%的腫瘤消退，連續(xù)觀察3個月，80%的實驗鼠達到病理學意義上的治愈。Fox等〔5〕將大腸桿菌胞嘧啶脫氨基酶(CD)的基因克隆到拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)表達載體后聯(lián)合治療EMT6荷瘤小鼠，癌細胞對5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性提高500倍。Li等〔6〕用青春雙歧桿菌(B.adolescentis)攜帶編碼內(nèi)皮抑素基因的質(zhì)粒作用于肝癌小鼠模型，腫瘤生長抑制率達69.9%。實驗發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)VNP20009株可以抑制多種鼠源及人源移植瘤(包括轉(zhuǎn)移灶)的生長，包括鼠、人黑色素瘤，人結腸癌、肺癌、乳腺癌等，VNP20009聚集在腫瘤部位的量是正常組織的1 000倍，動物的生存時間延長〔7〕。減毒沙門菌VNP20009Ⅰ期臨床試驗表現(xiàn)出較好的安全性；單獨使用C.novyi-NT芽孢或聯(lián)合使用抗微管藥物治療實體瘤也已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗〔8〕。

3 厭氧菌抗腫瘤的機制

厭氧菌在腫瘤治療中的應用主要表現(xiàn)為直接溶瘤效應、治療基因載體及聯(lián)合溶菌療法等幾個方面。

3.1直接溶瘤效應 某些厭氧菌的菌體成分和代謝產(chǎn)物本身具有細胞毒性，能直接發(fā)揮溶瘤作用。Baban等〔9〕發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌、沙門菌能在腫瘤實體內(nèi)自我增殖，與腫瘤細胞競爭營養(yǎng)及生長因子，或其毒性產(chǎn)物破壞腫瘤微環(huán)境，顯示出直接溶瘤效應。Mǒse等〔10〕從土壤中分離出無致病性的酪酸梭狀芽孢桿菌M55，動物實驗觀察到M55靶向定植于腫瘤乏氧區(qū)及較大的壞死區(qū)，表現(xiàn)出溶瘤作用；病理切片顯示，腫瘤中央液化壞死，周邊仍有存活的腫瘤細胞。Dang等〔4〕使用C.novyi-NT分別治療荷HCT116和B16裸鼠，腫瘤生長受到抑制，組織培養(yǎng)和免疫熒光顯微鏡觀察證實該菌特異性定植于腫瘤組織，且腫瘤壞死區(qū)周圍也有細菌生長，蘇木精-伊紅染色見腫瘤中央大量液化壞死，未觀察到裸鼠毒副反應表現(xiàn)。S.typhimurium是一種兼性厭氧菌，它在腫瘤壞死區(qū)和活性區(qū)都可以生長，Zhao等〔11〕將亮氨酸、精氨酸雙向營養(yǎng)缺乏型鼠傷寒沙門菌(S.typhimuriumA1)尾靜脈注射結腸癌裸鼠模型，觀察到S.typhimuriumA1對腫瘤的黏附性增強了6倍左右，對腫瘤組織的侵蝕范圍更廣，表現(xiàn)出強大的溶瘤能力。

3.2治療基因載體 厭氧菌具有安全性高、靶向性強、不易引起正常細胞轉(zhuǎn)化、潛在的副作用低、使用方便、易生產(chǎn)和保存等優(yōu)點，使解決腫瘤基因治療缺乏特異性、安全性載體的問題有了新的希望。

3.2.1前體藥物轉(zhuǎn)化酶基因載體 細菌導向的前藥酶療法(BDEPT)是利用厭氧菌將前藥活化酶基因靶向轉(zhuǎn)運至腫瘤組織內(nèi)表達，再全身應用無毒的前藥，使前藥僅能在腫瘤組織內(nèi)被活化成抗腫瘤活性的藥物，從而克服直接應用化療藥物無選擇性、瘤內(nèi)濃度低、易引起毒副作用及耐藥性的不足〔12〕。胞嘧啶脫氨酶(CDase)是前體藥5-氟胞嘧啶(5-FC)的活化酶，能將5-FC活化成放射敏感性的毒性5-FU。Matsumura等〔13〕構建了攜帶質(zhì)粒pBLES100-S-eCD的長雙歧桿菌105-A，利用其表達的CDase基因?qū)?-FC轉(zhuǎn)換成抑制腫瘤生長的5-FU來治療腫瘤，降低了傳統(tǒng)化療藥物的不良反應。Mei等〔14〕將CDase導入減毒沙門菌VNP20009內(nèi)，聯(lián)合5-FC靜脈注射荷瘤鼠，在腫瘤組織內(nèi)檢測到活化的5-FU，而其他正常組織未發(fā)生轉(zhuǎn)化。Mionton等〔15〕構建了C.beijerinckiiNCIMB8052重組體，表達來源于大腸桿菌的CDase或硝基還原酶(NTR)。Theys等〔16〕將NTR 轉(zhuǎn)入?yún)捬跹挎咚缶?，靜脈注射重組菌芽孢，抑制腫瘤生長的能力顯著增強。Liu等〔17〕應用梭狀芽孢桿菌兩個內(nèi)源性強啟動子(thlP和abrBP)代替原始啟動子fdP，構建出新的NTR表達載體，其表達能力提高了近20倍。體內(nèi)試驗表明，梭狀芽孢桿菌能有效地將前體藥CB1954轉(zhuǎn)化為腫瘤毒性藥物，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應。

3.2.2細胞因子基因載體 厭氧菌也常用作細胞因子的表達載體，通過促發(fā)腫瘤細胞凋亡信號傳導通路，引起腫瘤細胞凋亡，或誘導免疫反應間接清除腫瘤細胞。Hu等〔18〕將攜帶腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體質(zhì)粒的長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum,B.longum)注射荷瘤小鼠，小鼠骨肉瘤縮小。Yi等〔19〕利用嬰兒雙歧桿菌攜帶pGEX-1λT質(zhì)粒注射小鼠，小鼠惡性黑色素瘤的生長受到抑制。Tang等〔20〕用嬰兒雙歧桿菌攜帶胸腺嘧啶激酶自殺基因質(zhì)粒靜脈注射荷膀胱癌小鼠，腫瘤的體積明顯減小。還有研究人員利用B.adolescentis和B.longum攜帶抗血管生成因子，將其注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，腫瘤血管生成受到抑制，腫瘤的體積亦明顯減小。Lee等〔21〕用攜帶有內(nèi)皮他丁表達載體的減毒豬霍亂沙門菌(S.choleraesuis)靜脈注射荷MTB-2腫瘤小鼠，腫瘤生長被抑制，小鼠存活時間延長，免疫組化分析顯示腫瘤內(nèi)微血管密度減小，血管內(nèi)皮生長因子表達減少、細胞滲透增加。Loeffler等〔22〕用轉(zhuǎn)有LIGHT細胞因子的減毒鼠傷寒沙門菌治療荷D2F2乳腺癌小鼠，流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中B細胞和CD4+T 、CD8+T細胞大量增加。Agorio等〔23〕將攜帶鼠白介素(IL)-4或IL-18基因的減毒傷寒沙門菌，口飼荷黑色素瘤小鼠，2 d后發(fā)現(xiàn)重組菌在瘤內(nèi)聚集，無論重組菌攜帶IL-4 還是IL-18基因，均能抑制腫瘤生長，顯著延長荷瘤小鼠的生存時間，小鼠血清中干擾素(IFN)-γ含量增加。Bermúdez-Hmarán等〔24〕將表達HPV16 E7抗原和IL-12的乳酸桿菌制成疫苗，接種小鼠后能誘導產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應，當以致死量攻擊表達E7抗原的TC-1腫瘤細胞時，小鼠獲得保護。對載體菌特性的分析表明，乳酸桿菌固有的免疫調(diào)節(jié)功能在表達抗原免疫原性時起重要作用〔25〕。使用活菌提高機體的免疫功能也是治療腫瘤的策略之一〔26〕。

3.3聯(lián)合溶菌療法 腫瘤乏氧區(qū)血供較差，化療藥物難以到達。放療殺死細胞離不開氧，因此放療一般只能殺死腫瘤邊緣有氧區(qū)的細胞，而乏氧區(qū)成為死角，造成腫瘤轉(zhuǎn)移、復發(fā)，厭氧菌聯(lián)合放療或(和)化療、射頻消融治療能增強抗腫瘤效果，統(tǒng)稱聯(lián)合溶菌療法(COBALT)。

3.3.1厭氧菌聯(lián)合化療 厭氧菌聯(lián)合化療藥物治療腫瘤可以起到相互協(xié)同作用。阿霉素的脂質(zhì)體Doxil能穿透腫瘤血管內(nèi)皮在瘤內(nèi)聚集，并在循環(huán)系統(tǒng)長期存留。Cheong等〔27〕聯(lián)合使用C.novyi-NT和Doxil靜脈注射荷瘤小鼠，腫瘤消退更明顯，動物存活時間延長。體內(nèi)藥物分布分析顯示，聯(lián)合治療方案中阿霉素在腫瘤內(nèi)濃度更高。Lee等〔28〕用減毒豬霍亂沙門菌聯(lián)合順鉑治療荷肝腫瘤或肺腫瘤小鼠，腫瘤生長顯著抑制，小鼠生存時間明顯延長，腫瘤內(nèi)中性粒細胞和CD8+T細胞增加，凋亡細胞也增加。

3.3.2厭氧菌聯(lián)合放療 乏氧增加了腫瘤對放射治療的抗性。由于缺氧，這些區(qū)域無法產(chǎn)生足夠的用來破壞增殖細胞DNA的氧自由基。利用厭氧菌對乏氧區(qū)的破壞作用可增強放療的效應。Bettegowda等〔29〕用C.novyi-NT分別聯(lián)合遠距放療、近距放療、放射免疫三種放療方法進行動物實驗，結果顯示C.novyi-NT能顯著提高放療效果，減少放療劑量，其中與近距放療聯(lián)合方案治愈率達到100%。破壞血管內(nèi)皮細胞可能是放療發(fā)揮作用的重要機制，因此與抗血管藥物類似，放療還起到了協(xié)同C.novyi-NT的作用。Bettegowda等〔29〕利用C.novyi-NT破壞腫瘤乏氧區(qū)，聯(lián)合放療或131I -單克隆抗體放射免疫療法可減緩小鼠移植瘤的生長。Platt等〔30〕聯(lián)合VNP20009與X線治療腫瘤，結果顯示出超疊加作用，放療同時增強了VNP20009抗腫瘤效應。

3.3.3厭氧菌聯(lián)合射頻消融治療 射頻消融(RF)能擴大腫瘤壞死區(qū)，為厭氧菌提供理想的增殖微環(huán)境。Wei等〔31〕利用C.oncolyticumM55芽胞治療861只小鼠頸部誘發(fā)腫瘤，試驗結果均顯示RF顯著增強了C.oncolyticumM55的溶瘤效果；對快速生長的Ehrlich腺癌，RF治療12 h后全身應用細菌芽孢效果最佳；對慢速增長的Ehrlich腺癌，RF+C.oncolyticumM55芽孢靜脈注射+放療三種方法聯(lián)合治療，治愈率為20%，生存時間延長，但原位復發(fā)仍使余下小鼠最終死亡。

4 展望

厭氧菌在腫瘤生物治療的應用中顯示出其優(yōu)越性，但其確切的機制還待深入研究。借助基因工程及宏基因組學技術進一步改造厭氧菌，使其更安全，成為更多治療藥物的載體，同時解決厭氧菌抗腫瘤窗口期的選擇、腫瘤大小的選擇、厭氧菌與腫瘤的量效關系、腫瘤非低氧區(qū)和小轉(zhuǎn)移灶的治療、減毒株毒力回復、溶瘤綜合征及厭氧菌單用或聯(lián)合放、化療及RF治療腫瘤的類型、給藥方法等問題之后，厭氧菌在腫瘤治療中的應用將會有更大突破。

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