活性氧在血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及膠原分泌過程中的作用

高 媛 孔衛(wèi)娜 張 鐸 李 雪 李 楠 柴錫慶

(河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

近期研究證明血管外膜中的主要細(xì)胞成分血管外膜成纖維細(xì)胞(VAF)對(duì)多種刺激具有應(yīng)答能力，被激活后獲得α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SM-actin)的表達(dá)特征，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)表型，然后可向中膜和新生內(nèi)膜遷移、增殖，同時(shí)大量合成膠原纖維，參與血管重塑過程。VAF的表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及膠原纖維的合成在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管介入治療后再狹窄等多種心血管疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用〔1〕。活性氧(ROS)可以增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的增生，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)障礙，促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞游移，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解等作用〔2，3〕。此外，ROS在VAF向MF細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及膠原纖維的合成過程中也發(fā)揮重要作用。本文就血管ROS的生成及ROS促進(jìn)VAF型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及膠原纖維合成的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 血管ROS的生成

ROS主要包括超氧陰離子(·O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)等。在血管系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶是ROS的主要來源。NADPH氧化酶是由多個(gè)亞單位組成的跨膜復(fù)合物，包括跨膜亞單位p22phox(調(diào)節(jié)亞基)、gp91phox(催化亞基)和胞質(zhì)亞單位p47phox、p67phox及小G蛋白R(shí)ac。其中，gp91phox有5種同系物，命名為Nox1-5，gp91phox即Nox2。內(nèi)皮細(xì)胞、中膜的平滑肌細(xì)胞、外膜成纖維細(xì)胞均有NADPH氧化酶的表達(dá)。當(dāng)血管受到各種內(nèi)外因素的刺激后，可誘導(dǎo)p47phox的磷酸化，p47phox的磷酸化促進(jìn)胞質(zhì)亞單位向細(xì)胞膜的易位并與跨膜亞單位p22phox相結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致gp91phox的催化活性被激活，將兩個(gè)電子傳遞給氧分子產(chǎn)生·O2-。·O2-存在的時(shí)間很短，很快在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下代謝為H2O2。·O2-和H2O2在鐵的催化下還可以通過Fenton反應(yīng)轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性極強(qiáng)的·OH〔4，5〕。

誘導(dǎo)血管ROS生成的因素很多，如血管機(jī)械性牽拉或損傷(如動(dòng)脈套管或球囊損傷〔6～8〕)、缺氧〔9〕、機(jī)體代謝異常造成的血糖〔10〕、血脂升高〔11〕均可通過激活NADPH氧化酶誘導(dǎo)ROS的生成。此外，各種病理因素導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子、激素等水平的改變也可誘導(dǎo)ROS的生成。AngⅡ可激活所有類型血管細(xì)胞中的NADPH氧化酶，促進(jìn)ROS的生成〔12，13〕。近期研究〔14～17〕表明動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓等疾病過程與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1有著密切的聯(lián)系。TGF-β1表達(dá)的異常升高是促使血管重塑的主要因素之一〔14〕。TGF-β1也可以激活所有類型血管細(xì)胞中的NADPH氧化酶，促進(jìn)ROS生成〔15～17〕。

2 ROS促進(jìn)VAF的表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及膠原纖維的合成

2.1ROS促進(jìn)VAF的表型轉(zhuǎn)化 ROS水平的升高在VAF/MF的表型轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮重要作用。例如，AngⅡ誘導(dǎo)VAF ROS的生成可以導(dǎo)致α-SM-actin表達(dá)的升高，促進(jìn)VAF向MF的表型轉(zhuǎn)化；相反，用自由基清除劑(NAC)清除ROS，或用NADPH氧化酶抑制劑(DPI)抑制NADPH氧化酶的活性，或通過轉(zhuǎn)染gp91phox的反義小核苷酸片段抑制NADPH氧化酶催化亞基的表達(dá)，減少ROS的生成，均可以抑制VAF向MF的表型轉(zhuǎn)化，使α-SM-actin的表達(dá)降低〔18〕。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)ROS生成后可導(dǎo)致p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和C-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平升高，p38 MAPK/JNK信號(hào)通路被激活，促進(jìn)α-SM-actin的表達(dá)，導(dǎo)致VAF/MF的表型轉(zhuǎn)化。相反，用DPI或gp91phox的反義小核苷酸片段抑制NADPH氧化酶的活性，降低AngⅡ誘導(dǎo)的ROS的生成，或用N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除生成的ROS，均可降低p38 MAPK和JNK的磷酸化水平，α-SM-actin的表達(dá)也隨之下降，VAF/MF的表型轉(zhuǎn)化同時(shí)受到抑制；若用p38MAPK的抑制劑(SB202190)或JNK的抑制劑(SP600125)同樣能夠降低AngⅡ誘導(dǎo)的α-SM-actin的表達(dá)〔18〕。上述研究證實(shí)，在AngⅡ誘導(dǎo)的VAF/MF的表型轉(zhuǎn)化過程中，NADPH氧化酶-ROS-p38 MAPK/JNK信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用。

TGF-β1也可通過促進(jìn)ROS的生成誘導(dǎo)VAF向MF的表型轉(zhuǎn)化。郭淑杰等〔19〕采用寡核苷酸芯片技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)VAF表型轉(zhuǎn)化過程中基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)在此過程中NADPH氧化酶表達(dá)顯著升高，說明NADPH氧化酶及其生成的ROS可能參與TGF-β1誘導(dǎo)的VAF的表型轉(zhuǎn)化過程。Fleenor等〔17〕研究證實(shí)了上述推測(cè)，用TGF-β1處理體外培養(yǎng)的VAF，VAF內(nèi)ROS水平升高的同時(shí)，α-SM-actin的表達(dá)顯著增加；相反，用小干涉RNA(siRNA)抑制NADPH氧化酶的表達(dá)，細(xì)胞ROS的水平降低，可顯著削弱TGF-β1誘導(dǎo)的VAF α-SM-actin的生成，VAF/MF的表型轉(zhuǎn)化受到抑制，上述研究證實(shí)ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的VAF/MF表型轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)的VAF ROS的生成可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子Smad2和Smad3磷酸化水平升高；相反，抑制NADPH氧化酶的表達(dá)，降低ROS水平，TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著降低；若用反義小核苷酸片段抑制Smad2和Smad3的表達(dá)，TGF-β1誘導(dǎo)的VAF/MF的表型轉(zhuǎn)化同樣受到抑制〔20，21〕。

2.2ROS促進(jìn)VAF的增殖 細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，用TGF-β1處理原代培養(yǎng)的主動(dòng)脈VAF 24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，同時(shí)VAF增殖顯著增加，并且檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)Smad2、Smad3及磷酸化的Smad2、Smad3水平顯著升高；相反，用反義小核苷酸片段抑制Smad2和Smad3的表達(dá)，可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的VAF增殖〔21〕。上述研究證實(shí)，ROS-Smads 2/3信號(hào)通路在TGF-β1誘導(dǎo)的VAF增殖過程中同樣發(fā)揮重要作用。

除此之外，研究還證實(shí)血管損傷或缺氧也可誘導(dǎo)ROS的生成，促進(jìn)VAF增殖。血管損傷導(dǎo)致豬冠狀動(dòng)脈VAF內(nèi)ROS水平升高，并顯著促進(jìn)了VAF的增殖；相反，用抗氧化劑(Tiron、Catalase)清除ROS，或用DPI抑制NADPH氧化酶的活性，減少ROS的生成，均可顯著抑制血管損傷導(dǎo)致的VAF的增殖〔7〕。缺氧也可以上調(diào)肺動(dòng)脈VAF NADPH氧化酶的表達(dá)，使ROS水平升高，誘導(dǎo)肺動(dòng)脈VAF的異常增殖；用siRNA技術(shù)抑制肺動(dòng)脈VAF NADPH氧化酶的表達(dá)，降低ROS的生成，可抑制缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈VAF的異常增殖〔22〕。

2.3ROS促進(jìn)VAF的遷移 ROS在VAF轉(zhuǎn)化為MF后向中膜和新生內(nèi)膜遷移的過程中同樣發(fā)揮重要作用。利用轉(zhuǎn)膜腔(Transwell Chamber)培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VAF，用AngⅡ進(jìn)行處理，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VAF的遷移，同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高；相反，抑制內(nèi)源性NADPH氧化酶的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，可削弱AngⅡ誘導(dǎo)的VAF的遷移〔23〕。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，用SB202190幾乎能夠完全阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的VAF遷移活動(dòng)〔24〕。上述研究結(jié)果提示NADPH氧化酶-ROS-P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在AngⅡ誘導(dǎo)的VAF遷移過程中發(fā)揮重要作用。

體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VAF，用TGF-β1進(jìn)行處理，Transwell Chamber測(cè)試細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示隨著TGF-β1濃度或作用時(shí)間的增加，誘導(dǎo)遷移的VAF細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS水平的逐漸升高；相反，抑制NADPH氧化酶的活性，降低細(xì)胞ROS水平，可顯著削弱TGF-β1誘導(dǎo)的VAF遷移活動(dòng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)VAF ROS生成，促進(jìn)其遷移活動(dòng)發(fā)生的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Smad2、Smad3、磷酸化Smad2、Smad3水平也顯著提高；若抑制Smad2和Smad3的表達(dá)，可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的VAF的遷移〔21〕。上述結(jié)果證實(shí)，在TGF-β1促進(jìn)VAF遷移的過程中同樣涉及ROS-Smads 2/3信號(hào)通路。

2.4ROS促進(jìn)VAF膠原纖維的合成 VAF經(jīng)向MF的表型轉(zhuǎn)化及向內(nèi)膜遷移、增殖的同時(shí)，分泌的膠原纖維增加，尤其是Ⅰ型膠原蛋白分泌增多，并在血管外膜和新生內(nèi)膜沉積，導(dǎo)致血管纖維化，血管管腔縮窄等病理性血管重塑的發(fā)生。An等〔25，26〕研究顯示，AngⅡ誘導(dǎo)的VAF ROS水平的升高會(huì)促進(jìn)VAFⅠ型膠原的分泌；相反，使SOD基因過表達(dá)，或者用SOD、四甲基哌啶(Tempol)或肽鐵試劑(Tiron)清除過量的ROS，或用DPI抑制NADPH氧化酶的活性，或?qū)p91phox的基因敲除，使VAF內(nèi)ROS的生成減少，均可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VAFⅠ型膠原的合成。上述研究證實(shí)，ROS在AngⅡ誘導(dǎo)的VAFⅠ型膠原的合成過程中發(fā)揮重要作用。An等〔25，26〕研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AngⅡ通過誘導(dǎo)VAF ROS生成后，首先促進(jìn)內(nèi)皮素(ET)-1的分泌，ET-1與其受體(ETA)結(jié)合后，再進(jìn)一步促進(jìn)VAFⅠ型膠原的合成；相反，過表達(dá)SOD基因，或用SOD、Tempol或Tiron清除過量的ROS，或用Apocynin或DPI抑制NADPH氧化酶的活性，或?qū)p91phox的基因敲除，降低ROS的生成，ET-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均受到抑制，Ⅰ型膠原的合成也隨之降低；若用ETA的拮抗劑(BQ-123)抑制ET和ETA的相互作用，也可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VAFⅠ型膠原的合成。上述研究證實(shí)AngⅡ通過激活VAF NADPH氧化酶，誘導(dǎo)ROS的生成，促進(jìn)ET-1的合成和分泌，ET-1又通過自分泌的方式和其受體ETA相作用，誘導(dǎo)Ⅰ型膠原的合成。

TGF-β1也可通過誘導(dǎo)VAF ROS的生成促進(jìn)膠原纖維的合成，使血管的彈性降低，硬度增加〔17〕，這其中也涉及Smads 2/3信號(hào)通路〔21〕。

3 總結(jié)及展望

目前，研究已經(jīng)證實(shí)一些藥物可以通過其抗氧化作用抑制VAF的表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，改善動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和介入治療后再狹窄等疾病的病理性血管重塑〔27〕。例如，抗壞血酸(AA)可通過其抗氧化作用顯著抑制NO誘導(dǎo)的VAF增殖〔28〕。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ激動(dòng)劑可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈VAF ROS的生成，并抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VAF的遷移活動(dòng)和Ⅰ型膠原纖維的分泌〔29〕。老年C57BL6小鼠在服用氧自由基清除劑3 w后，動(dòng)脈ROS的水平顯著降低，VAFⅠ型膠原的分泌顯著減少，老年鼠動(dòng)脈硬化的程度也有所緩解〔30〕。因此，對(duì)ROS在血管重塑病變中的作用機(jī)制的深入研究將為心血管疾病的臨床治療提供重要的理論支持。

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