靜脈血栓栓塞癥患者蛋白C和蛋白S基因單核苷酸多態性分析

李方超 靳會敏 佟 倩

(吉林大學第一臨床醫院心血管內科，吉林 長春 130021)

機體內的抗凝系統和凝血系統處于一個動態平衡的狀態，當凝血系統被激活占優勢時，則出現血栓栓塞性疾病。在機體內發揮重要抗凝作用的3個體系：抗凝血酶、蛋白C(PC)系統和組織因子途徑抑制物。PC和蛋白S(PS)與凝血酶調節蛋白(TM)和活化PC抑制物(APCI) 共同組成PC系統，在抗凝過程中起重要作用。人類基因組中存在著廣泛的多態性，最簡單的多態形式是發生在基因組中的單個核苷酸的替代，即單核苷酸多態性(SNP)。通過探討靜脈血栓栓塞(VTE)患者PS和PC基因SNP，明確PS和PC基因多態性與VTE的關系，進一步明確中國人VTE的主要致病基因。

1 PC和PS的功能

PC是維生素K依賴性的絲氨酸蛋白酶原，主要由肝臟合成，是重要的抗凝物質。成熟的PC在結構上分成3個區域：(1)結合鈣離子的羧基谷氨酸(Gla)區域；(2)2凝血酶-TM復合物激活PC的2個表皮生長因子(EGF)同源區域；(3)PC的活性區域〔1〕。PC由內皮細胞的凝血酶和血栓調節蛋白復合體激活成為活化蛋白(APC)，PS是PC的輔助因子，是依賴維生素K的單鏈糖蛋白，主要由肝臟合成，可與PC結合，形成“APC-PS”復合體，該復合體使得凝血因子Va、Ⅷa更易被APC降解〔2〕。此外，PC還能夠抑制炎癥介質的釋放，參與機體抗炎及抗細胞凋亡作用〔3〕。

2 PC和PS的基因結構

PC基因位于2q13～q14，由9個外顯子(exon)和8個內含子(intron)組成，全長11.2 kb，由蛋白編碼區(exon 29)、5′端不翻譯區(exon 1加21bp exon 2)和294 bp的 3′端不翻譯區(exon 9)組成。具有轉錄活性的PS基因(PSa或PROSl基因)，位于染色體3P11.1～11.2上，DNA全長80 kb，含15個外顯子和14個內含子及6個重復的Alu序列。PS基因mRNA長約4 kb，由一個5′非翻澤區、一個蛋白編碼區以及3′非翻譯區組成。

3 PC和PS基因SNP

SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病易感性及藥物反應性個體差異的重要因素。SNP廣泛存在于人類基因組中的編碼序列以及非編碼序列上。位于編碼區內的SNP(cSNP)比較少，但在遺傳性疾病中卻有重要意義。cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP,即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP,指堿基序列的改變可使以其為模板翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。SNP是二等位基因，有利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs,從而使得檢測PC和PS基因SNPs更為便捷，在基因水平上尋找VTE病因并設計個體化的最佳治療方案。

4 PC和PS基因突變數據庫

SNP為基因突變提供基礎，PC和PS基因突變導致PC和PS缺陷，與靜脈血栓形成有關。目前根據Reistma〔4〕的統計,PC缺陷病例已達300多例，涉及160多種突變。PC缺陷屬于常色體顯性遺傳疾病，可分為Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅰ型缺陷PC總量和抗凝活性都降低；Ⅱ型缺陷是表達量正常，但抗凝血活性下降。PS基因突變數據庫登記的PS基因突變有180多種，PS缺陷屬常染色體顯性遺傳,分為3型：Ⅰ型是總的PS和游離的PS水平均降低；Ⅱ型主要是PS的功能活性降低，而總的及游離的PS水平仍正常；Ⅲ型以游離PS水平降低為顯著。吳瑛婷等〔5〕發現復合雜合性PC基因突變(R178W和D255H、L-34P和T295I)，使PC分泌障礙和細胞內降解，導致Ⅰ型遺傳性PC缺陷癥。周榮富等〔6〕發現PC基因C3135G、T6128G、6161～6163或6164～6166AAG缺失，分別導致C64W、F139V、K150d，從而導致PC缺陷。葉絮等〔7〕發現(exon 3)5540位堿基的G-A的雜合突變和位于(exon 7)10230位堿基C-T的雜合突變，導致E29K和R147W兩種錯義突變，導致PC缺陷。Lind等〔8〕報道Ser270Leu突變和Asp180Gly突變〔9〕可導致Ⅰ型PC缺陷癥。Song等〔10〕發現Val297Met導致突變蛋白在細胞內快速降解，導致Ⅰ型PC缺陷癥。Millar等〔11〕發現Gly347Ala突變導致I型PC缺陷,Trp380Gly導致Ⅱ型PC缺陷癥。Heerlen多態性位點(Ser460Pro)造成Ⅰ型PS缺陷癥,Beauchamp等〔12〕調查蘇格蘭人群發現，Heerlen多態性位點是造成遺傳性PS缺陷最普遍的原因。Leroy-Matheron等〔13〕研究發現PROS1(exon 15)2148A-G突變使血漿PS濃度下降。Espinosa-Parriua 等〔14〕發現PROS1(exon 10)TCA-TGA突變，導致Ⅲ型PS缺陷。Suzuki等〔15〕發現PROS1(exon 10)TGG-TAG突變，導致Ⅲ型PS缺陷。劉麗等〔16〕發現PROS1(exon 10)上第163位核苷酸發生G-T突變，在蛋白質合成過程中絲氨酸被終止密碼子替代(Ser-stop)，導致Ⅲ型PS缺陷。于麗俠等〔17〕發現ROS1 Tl378C和K196E〔18〕多態性與新疆地區漢族人肺栓塞的發生可能有關。葉絮等〔19〕發現PROS1(exon 10)發生了C82792T雜合點突變，即R314C雜合突變，導致PS缺陷癥。

通過檢測VTE患者PC和PS基因SNP，明確PC和PS基因多態性與VTE的關系，進一步明確中國人VTE的主要致病基因，并設計個體化的最佳治療方案。并且可以建立中國人PC和PS基因突變數據庫，將這些致病基因制成基因探針，便于篩選出高?；颊撸扇《喾N預防措施，防病于未然，減少該病的發病率及死亡率。

5 參考文獻

1沈永才，章金剛，倪道明，等.重組人蛋白C的研究進展〔J〕.生物技術通訊，2002；6(13)：453-5.

2Esmon CT.Molecular events that control the protein C anticoagulant pathway〔J〕.Thromb Haemost，1993;70(1)：29-35.

3Rodstrom PO,Jontell M,Mattsson U，etal.Cancer and oral lichen planus in a Swedish population〔J〕.Oral Oncol，2004;40(2)：131-8.

4Reistma PH.Protein C deficiency:summary of the 1995 database update〔J〕.Nucleic Acids Res,1996;24:157-9.

5吳瑛婷,丁秋蘭,戴 菁,等.復合雜合蛋白C基因突變致靜脈血栓的分子發病機制研究〔J〕.血栓與止血學,2010;16(5):198-215.

6周榮富，蔡曉紅，謝 爽，等.蛋白C基因C64W和F139V突變致蛋白C缺陷的分子機制研究〔J〕.中華血液學雜志，2007;28(3):156-9.

7葉 絮，劉曉力，馮 瑩，等.蛋白C基因復合雜合突變導致的肺栓塞及家系研究〔J〕.南方醫科大學學報，2012；32(1):109-12.

8Lind B,Koefoed P,Thorsen S.Symptomatic type 1 protein C deficiency caused by a de novo Ser270Leu mutation in the catalytc domain〔J〕.Br J Haematol,2001;113(3):642-8.

9Lind B,Gedde-Dahl T,Tjnnfjord G,etal. Protein C deficiency caused by homozygosity for a novel PROC D180G mutation in vitro expression and structural analysis of the mutation〔J〕.Thromb Haemost,2002;88(4):632-8.

10Song KS,Park YS,Choi JR,etal.A molecular model of a point mutation in the serine protease domain of protein C〔J〕.Exp Mol Med,1999;31(1):47-51.

11Millar DS,Johansen B,Berntorp E,etal.Molecular genetic analysis of severe protein C deficiency〔J〕.Hum Genet,2000;106(6):646-53.

12Beauchamp NJ，Dykes AC，Parikh N,etal.The prevalence of，and molecular defects underlying,inherited protein S deficiency in the general population〔J〕.Br J Haematol,2004;125(5)：647-54.

13Leroy-Matheron C，Duchemin J，Levent M，etal.Genetic modulation of plasma protein S levels by two frequent dimorphisms in the PROSl gene〔J〕.Thromb Haemost，1999;82：1088-92.

14Espinosa-Parriua Y,Morcell M,Souto JC,etal.Protein S gene analysis reveals the presence of a cosegegating mutation in most pedgrees with type Ⅰ but not type Ⅲ PS deficiency〔J〕.Hum Mut,1999;14:30-9.

15Suzuki K,Protein S.In:Katherine A,High-Harokd R,ed.Molecular basis of thrombosis and homeostasis〔M〕.New York:Marcel Dekker Inc,1995:495-6.

16劉 麗,賀立山,楊 爽，等.遺傳性蛋白S缺陷癥一個新的基因突變〔J〕.中華血液學雜志,2001;22(9):457-60.

17于麗俠,楊曉紅,鄔 超,等.肺血栓栓塞癥患者PROSITl378C多態性探討〔J〕.臨床肺科雜志，2011;16(4):533-5.

18楊曉紅,于麗俠,鄔 超.新疆維族肺血栓栓塞癥患者的PS-K196E多態性探討〔J〕.中華肺部疾病雜志,2010;3(3):172-6.

19葉 絮，劉曉力，馮 瑩，等.蛋白S基因突變導致深靜脈血栓形成的研究〔J〕.南方醫科大學學報，2011；31(7):1228-31.