不同生長基質(zhì)對骨骼肌成肌干細(xì)胞分化融合的影響及初步分析

李曉雨 高穎娜 湯維芳 李 孟 鄭宏良

在機體中肌肉受到損傷或其他方式損害時，處于靜態(tài)狀態(tài)的成年骨骼肌干細(xì)胞被激活后增殖、遷移到指定的位點相互融合或受損的肌纖維形成新的肌纖維［1］。在體內(nèi)和體外，細(xì)胞外基質(zhì)在決策細(xì)胞命運和行為中發(fā)揮了重要的作用［2］。細(xì)胞外基質(zhì)主要功能是支持各種細(xì)胞的生長和維持。同時細(xì)胞外基質(zhì)在骨骼肌肌纖維的力傳遞，維持和修復(fù)中起著重要的作用。在損傷和患病狀態(tài)，細(xì)胞外基質(zhì)顯著性的改變從而改變肌肉功能的屬性［3］。本研究組在體外分化培養(yǎng)小鼠骨骼肌成肌干細(xì)胞C2C12的基礎(chǔ)上，探討了3種常用細(xì)胞外生長基質(zhì)基質(zhì)膠、Ⅰ型膠原、多聚賴氨酸對C2C12細(xì)胞分化形成肌管融合率的影響。

材料與方法

1．材料:細(xì)胞:C2C12細(xì)胞株(ATCC)試劑:高糖DMEM(Gibco公司)，F(xiàn)BS(Gibco公司)，Matrigel(BD Bioscience公司)，PLL、CollagenⅠ(Sigma 公司)，肌球蛋白(myosin)兔抗鼠抗體(Sigma公司)，Dylight488驢抗兔熒光二抗(Jackson公司)。

2．Matrigel、CollagenⅠ、PLL 的鋪制:按照表1中的溶液量分別加入24孔板，把鋪制的24孔板放入CO2孵箱中過夜，然后在無菌超凈臺中吸出多余的液體，然后在紫外燈下照射2h，隨后無菌狀態(tài)下自然風(fēng)干后，即可加入細(xì)胞培養(yǎng)。

表1 3種生長基質(zhì)的鋪制參數(shù)

3．細(xì)胞分化培養(yǎng):C2C12細(xì)胞復(fù)蘇后，用10%FBS的高糖DMEM增殖培養(yǎng)液傳3～4代，待細(xì)胞狀態(tài)良好時，用0．05%胰酶-EDTA消化后制成密度為1．5×105/ml的細(xì)胞懸液，按1毫升/孔加入各已預(yù)鋪制的24孔板，CO2孵箱中過夜后，更換為2%HS的高糖DMEM分化培養(yǎng)基，隔天換液1次，第5日時可見大量及多核肌管形成。

4．細(xì)胞免疫熒光:常溫下用冷的4%多聚甲醛將分……